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如何保护高效液相色谱柱以提高其使用寿命 液相色谱操作规程

时间:2020-06-20    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】色谱柱用久后常出现柱压升高,柱效降低,峰形畸变,保留时间改变等变化,如不采取适当措施,色谱柱将无法再使用,缩短色谱柱的使用寿命。在高效液相色谱仪的使用中



    色谱柱用久后常出现柱压升高,柱效降低,峰形畸变,保留时间改变等变化,如不采取适当措施,色谱柱将无法再使用,缩短色谱柱的使用寿命。在高效液相色谱仪的使用中,保持高效液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性,延长柱子的使用寿命非常重要。

    1、流动相对色谱柱的损害因素

    颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下,微小的颗粒杂质很容易使柱子发生堵塞,因此使用的溶剂应当过滤,柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻挡颗粒物进入柱中。

    水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时,应防止细菌的生长,五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时,一些厌氧霉菌可能在色谱柱中滋生,堵塞固定相颗粒间的空隙。

    pH值:对硅胶基键合相填料,水溶液pH值不可超过2-7.5这一范围,当pH>8时,硅胶会释出

    生成絮状物堵塞柱子,且难以复原,柱效很快降低,甚至完全失效。

    盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时,其中的盐类溶解度下降,可析出盐类沉淀,堵塞柱子;加入粘度不同的样品溶液也可能发生类似现象。所以缓冲液中盐的浓度宜低,样品提取液的组成应和流动相匹配。

    2、样品对色谱柱的损害因素

    杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞,样品也应进行过滤处理。

    样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等,可以采取加装保护柱,或使用适应的溶剂反冲来处理。常用溶剂有四氢呋喃(适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油)、高浓度的脲或盐酸胍溶液(使蛋白质改性而洗脱)、高离子强度的磷酸盐缓冲液(pH=7,适合反相柱和离子交换柱,可除去蛋白质和醣等)。

    样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重,NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点,使保留时间缩短,因此羰基化合物样品和流动相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。

    活性点被覆盖:由于固定相吸附样品中的组成或杂质而使活性点被覆盖,在柱压升高的同时保留时间减少,将样品过滤或使用萃取分离柱(对大分子有机物如蛋白质、白细胞等)效果较好。

    3、色谱柱固定相的化学变化

    色谱柱固定相分解、活性基团变性以及键合相基团脱落会使保留时间显著变化。

    1、键合相基团脱落

    绝大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上,形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为、G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂,使键合相基团脱落,对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落,可增加流动相的有机溶剂量,降低离子强度和pH值,对基团已脱落的固定相,可用合适的硅烷试剂再生。

    2、固定相分解或活性基团变性

    例如氰基柱的保留时间显著缩短,但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化,证明未发生—CN水解成-COOH反应,而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。

    4、高效液相色谱柱的保养

    色谱柱在使用一段时间后,常遇到柱子受污染,柱效下降的问题,采用适当的方法对色谱加以保护和再生,能够延长色谱柱的使用寿命。





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  【中国仪器网 维修保养】液相色谱仪是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异,对混合物进行先分离,而后分析鉴定的仪器。
  

  一、泵的使用和维护
  
  1、防止固体微粒进入泵内。因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞杆、密封环、缸体和单向阀。泵的入口都应连接砂滤棒,输液棒的滤器经常清洗或更换。
  
  2、流动相不应含有任何腐蚀性物质。例如氯仿、丙酮、二氯甲烷等,这些溶剂将会Peek树脂部件变脆;还有含有卤离子的流动相或能产生卤离子的流动相,如果使用了,分析结束后,应立即用去离子水清洗整个管路,因卤离子会腐蚀不锈钢部件或管路。流动相含有缓冲盐不应停泵保留在泵内时间过长,由于蒸发甚至由于溶液的净置就可能析出晶体。
  
  3、泵工作时要注意流动相不要被用完,否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的压力不要太高,否则会使密封圈变形,降低密封圈使用寿命。
  
  4、在使用双泵过程中,如果不是梯度洗脱,尽量先混合。如果一个是有机溶剂,一个是含盐溶液,在用双泵的时候,有可能会析出晶体。
  
  5、在使用缓冲盐作流动相实验结束之前和结束后,都要用含10%甲醇水溶液冲洗管路,不能用纯水冲洗,因纯水会对柱子造成损坏。进样阀要用适宜的溶剂进行清洗。
  
  二、色谱柱的使用和维护
  
  1、避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候,进样阀扳手不能转动太慢,更不能停留在中间,如停留在中间,泵内压力剧增,这时再转动到进样位置时,过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动(掉在地上)则会改变填料的充填状态。
  
  2、在使用色谱柱过程中,不应直接从有机溶剂到水,反之,也不要从水直接改变到有机溶剂。
  
  3、色谱柱一般不能反冲,除非生产者指明。
  
  4、冲洗色谱柱时,每种溶剂至少冲洗50ml。
  
  5、装在机子上的色谱柱,应每隔4~5天冲洗15分钟,可以避免长菌,保护色谱柱。
  
  6、PH的调节尽量在2~9之间
  
  7、保存色谱柱时,柱接头要拧紧。
  
  三、输液泵产生故障及排除方法
  
  1、没有流动相流出,又无压力显示。原因可能是泵内有大量气体,这时打开排液阀,使泵在较大流量下运转,将气体排出,也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因使密封圈损坏。
  
  2、压力和流量不稳。原因①可能有气泡;②单向阀污染,可卸下单向阀,浸入异丙醇内超声清洗;③沙滤棒内有杂质或微生物堵塞,可将沙滤棒浸入流动相中超声清洗,也可将滤头放入4mol/l硝酸溶液中,迅速除去微生物。也可能是盐堵塞,可放入水中清洗;④在线过滤器堵塞⑤进样阀损坏;⑥密封圈性能不好。
  
  3、压力过高。①管路堵塞;②保护柱堵塞;③检测池堵塞,发生情况立即停泵,否则会损坏流通池。
  
  四、与检测器有关的故障及其排除
  
  1、流通池内有气泡。如果有气泡连续不断通过检测池,将其噪音增大。如有较大气泡,则会在基线上出现许多线状“峰”,可加大流量排出气体。如果检测池有停留的气泡,可采用突然增大流量的方法排除气体(不连接色谱柱)。
  
  2、检测池被污染。检测池被污染了,可能产生噪音,或基线漂移,可以使用适当溶剂清洗,如果污染严重,就可以用1mol/l硝酸溶液、水和新鲜溶剂进行清洗。
  
  3、光源灯出现故障。检测器的光远灯不能满足正常样品分析时,可能产生严重噪音污染,基线漂移,出现异常峰,甚至基线不回零。
  
  4、出现倒峰。如果流动相有紫外吸收的杂质,使用紫外检测器时,就会产生倒峰,必须用高纯度的溶剂作为流动相。检测器的极性接反了,也会出现倒峰。

高效液相色谱仪的系统组成与特点

  高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述其各自的组成与特点。

  1.进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

  2.输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。

  3.分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

  另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小,会提高分辨率的道理。再者,高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短分析时间,就可增加层析柱的效率。

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