高效液相色谱结构组成 液相色谱操作规程

使用前，要将液相色谱柱进行柱的性能测试，并保存结果，作为以后评价柱性能变化的参考。注意点：1.柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；2.为了测得的结果才有可比性，在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较佳条件)。

1、样品的前处理
  a、可以使用流动相溶解样品。
  b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
  c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵  的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
  因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求较佳柱效，可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用较佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水 可以使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。可以加入叠氮化钠，防止  细菌生长。
d．流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

    在进行液相色谱仪分析实验时，流动相再进入仪器之前，必须使用超声波清洗机进行简单的除气泡处理，以防对泵造成损害，对检测结果造成干扰。若在检测过程中发现液相色谱仪恒流泵里有气泡，须及时进行排除，排除高压液相色谱仪泵中气泡的方法如下。

    1、首先，检查流动相储液瓶中的溶剂过滤头是否阻塞。具体做法：将输入三通器上的溶剂塑料连接管的卸下，将流动相储液瓶置于高位，利用压差使溶液流出。如果溶剂流的很顺畅，说明溶剂过滤头是好的。如果是一滴一滴的流出，则说明过滤头阻塞，需要超声清洗，复原。

    2、用堵头将仪器的高压液流输出口封住将色谱柱连在管路上、，可避免在抽液时将空气抽入管路内。将仪器所配的注射器及塑料连接管插到放空阀的导管上，逆时针旋开放空阀旋钮，抽液5-10mL，将泵的流速设定在每分钟一毫升的流速。启动泵，观察塑料连接管的流动溶液是否还有气泡。如没有气泡说明从过滤头到放空阀这一段已将气泡排除。

    3、将泵关闭，将堵头从仪器的高压液流输出口去掉将色谱柱从管路上卸掉、使输出口放空。顺时针关闭放空阀旋钮，将泵的流速设定在3-5mL的流速，将泵内的阻尼器和压力传感器的气泡赶出，流出溶液10-15mL将泵关闭。连接上色谱柱，将流速设定在每分钟一毫升，启动泵，观察压力及压力脉动。

    4、用水和异丙醇甲醇、交替冲洗泵的内腔，使吸附在内墙壁上的气泡赶出。

    5、应用快速降压法赶出气泡：用小堵头将泵的流动相输出口堵上，将流速设定在1毫升/分，将柱前压力升至20Mpa左右，将排空阀快速打开，重复2~3即可。