凝胶过滤色谱柱 色谱柱操作规程

    当色谱柱使用一段时间以后，柱内由于各种原因，滞留了一些高沸点组分或氧化物等，除柱效有所下降外，还可能出现基线波动或“鬼峰”。为了去除污染物，使柱效和基线恢复到原来的状态，称为色谱柱的再生。色谱柱的再生和柱老化有一定区别和不同，它是柱在使用一段时间柱性能下降，经处理后尽量恢复到原来性能的过程。
    A、色谱柱在以下几种情况必须再生处理
    a.使一段时间，柱效明显下降；
    b.柱被污染，特别是在程序升温时，基线漂移和噪声超过容忍程度或出现“鬼峰”；
    c.柱头塌陷，柱床短路或断位(在玻璃柱中容易发现)，而出现尖峰或双重峰；
    d.峰形展宽，保留时间明显变化；
    e.待分离组分和固定相表面非特异性相互作用，引起保留时间较短的峰拖尾或出现双峰；
    B、毛细管柱再生的几种方法
    a.用载气将色谱柱污染物冲洗出来；
    b.将柱头截去100mm 或更长一些；
    c.若使用交联的色谱柱，可在仪器上反复注射溶剂进行冲洗。常用的溶剂依次为丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可进样5～10μL；
    d.交联柱在仪器上冲洗无效时，可把柱拆下来用二氯甲烷或氯仿冲洗，溶剂用量视柱的污染程度而定，一般20mL 左右。
    C、色谱柱再生前应注意的问题
    当分析出现问题时，不能只考虑是柱问题，而马上进行再生。除上述情况外，还应考虑样品处理、进样技术、操作有无失误、数据处理参数有无改变等可能带来的问题。
    a.衬管、预柱和检测器被污染也会引起基线不稳定、出现“鬼峰”或裂解峰；
    b.新的注射垫也会引起基线漂移和出现“鬼峰”；
    c.衬管密封欠佳、柱安装死体积或检测器固有特性也会引起较早出现峰的拖尾；
    d.分析系统发生变化(如漏气严重)也可能使保留时间突变；
    e.峰变宽，除柱效下降外也可能由柱外效应引起；
    f.进样量太大也会引起峰变宽、拖尾或保留时间变短；
    g.色谱柱长时间样品过载，保留时间也会变小等。
    D、色谱柱再生时应注意的几个问题
    1.如前所述和色谱柱老化一样，不是温度越高越好，时间越长越好；建议不要使用长时间烘烤的方法，来处理受到污染的色谱柱，因为烘烤时，温度会把污染的残留物变成不能溶解的物质，再用溶剂清洗也无济于事；
    2.仪器在高灵敏度操作时，如：量程在1×10-11A/mV以下，痕量分析程序升温过程中，温度升到大于180℃后，基线明显漂移是不可避免的；
    3.不同类型柱子，再生方法不同；
    4.样品种类、组分、进样量不同或操作时间长短不同，再生方法也不同；
    5.仪器本身条件如：气源种类、纯度、净化条件、进样口结构和操作检测器不同，再生柱方法也有区别；
    6.高分子量组分污染色谱柱后，高温再生时间长会导致固定相的老化；使用交联或键合柱可以用溶剂漂洗再生，漂洗溶剂流动方向一定要从柱出口注入。应该注意，毛细管柱交联键合率通常不到90%，因此会漂洗掉未化学结合的液相部分，所以保留时间和分离状态会有所变化；
    7.对于难挥发物，碳化物是不能通过再生除去，对于填充柱可以使用带衬管气化室进样器，对于毛细管可通过把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有条件的可以使用预柱，把不挥发的有机物、无机物和颗粒材料阻留在预柱中，需要时更换预柱；
    8.在某些情况下，色谱柱要在温度极限附近使用，这时基线漂移和大噪声已不可避免，柱的再生要求只能视情况而定；
    9.不是所有色谱柱通过再生均能恢复原来性能。

柱子可以分为：加压，常压，减压。

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。

  减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。

  加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

  关于柱子的尺寸，应该是粗长的可以。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。

  关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。

  关于湿法、干法上样。湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。

  样品和硅胶的量有一种说法是，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。溶剂的选择。当然是较为便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。另外溶剂在过柱子后可以也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。

关于操作问题。

1 装柱。
  柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！

2 加样。
用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～4cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。

3 淋洗剂的选择。
  感觉上要使所需点在rf0.2～0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。

4 样品的收集。
  用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。

5 最后的处理。
柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，可以用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。