反相色谱柱的选择和使用 色谱柱如何操作

    液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。下面介绍一下反相色谱柱的选择和使用：

    一、反相色谱柱的选择

    1.柱子的PH值使用范围

    反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解;当PH值大于7时硅胶易溶解;经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。

    2.填料的端基封尾（或称封口）

    把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离;填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，可以选用填料经端基封尾的色谱柱。

    二、液相色谱柱的使用

    色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是较佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。

    1、样品的前处理

    a、可以使用流动相溶解样品。

    b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

    c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

    2、流动相的配制

    液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

    a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。

    b、流动相与样品不产生化学反应c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果;降低柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。

    d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

    e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

    f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

    3、流动相流速的选择

    因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求较佳柱效，可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

    当选用较佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

    注意：

    a.含水流动相可以在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。可以加入叠氮化钠，防止细菌生长。

    b.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

    c.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

    三.色谱柱的维护

    1.色谱柱的平衡

    反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!操作步骤：

    a.平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）

    b.如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡;分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。

    2.色谱柱的再生

    长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

    建议用来冲洗柱子的溶剂体积

    色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积

    125-4mm1.6ml30ml

    250-4mm3.2ml60ml

    250-10mm20ml400ml

    选择再生方法：

    极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：

    正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

    非极性固定相（如反相色谱填料RP-18，RP-8，CN等）的再生：水→乙腈→（或异丙醇）→乙腈→水

    注意：

    a.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

    3.色谱柱的维护

    a.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

    b.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

    c.避免流动相组成及极性的剧烈变化

    d.流动相使用前必须经脱气和过滤处理

    e.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中

    f.氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀

一、流动相的pH应在使用范围内
以硅胶为基质的反相色谱柱的pH范围为2~9，流动相超过其pH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂，使柱效下降，寿命变短。

二、去除样品和流动相汇总的固体颗粒
样品和流动相中含有固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45um滤膜。

三、使用保护柱或在线过滤器
保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱筛板孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例，因此除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。

四、正确使用缓冲盐
缓冲盐使用不当会使其在流动相（含有机溶剂）中析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上的键合的碳链自由舒展，使用色谱柱的保留能力下降，柱效降低。

建议使用前要过滤，使用后要冲洗。具体方法如下：
1、等度条件：使用缓冲盐前和使用后需要过滤流动相1.0ml/min流速冲洗60min.
2、梯度条件：用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前，用与初始流动相组成相同的过滤流动相似1.0ml/min流速冲洗60min；分析完成后，再用该过滤流动以1.0ml/min冲洗色谱柱120min。含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓，以避免梯度过程中缓冲盐析出。

五、柱清洗方法：
1、未使用缓冲盐：每天分析完成后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱60min。
2、使用过缓冲盐：分析完成后，先后用上述方法除去缓冲盐，然后再用纯甲醇或乙腈反向冲洗色谱柱60min。

    气相色谱柱除用于定量和定性分析外，还能测定样品在固定相上的分配系数、活度系数、分子量和比表面积等物理化学常数，是一种对混合气体中各组成分进行分析检测的仪器。广泛应用于石油、化工、生物化学、医药卫生、食品工业、环保等方面。

    选择气相色谱柱时要考虑到以下性能：

    1、柱长

    气相色谱柱柱长会影响到柱效、保留（分析时间）和载气压力。

    如果不知道较佳长度，优先使用25-30米长的色谱柱；10-15米的色谱柱十分适用于分离含有很容易分离溶质的样品或含溶质较少的样品；50-60米长的色谱柱适合分离含有很多组分的复杂样品，但是长的色谱柱的分析时间较长、费用也较高。

    2、内径

    0.15和0.18mm内径的色谱柱十分适用于泵容量低的GC/MS系统。内径较小的色谱柱具有的柱容量最小，并需要最高的柱头压；

    当需要较高的样品容量时，使用0.32mm内径的色谱柱。与0.25mm内径的色谱柱相比，它们对于不分流进样或大体积（>2?L）进样时早流出的溶质有更佳的分离度；

    只有在仪器配备大口径直接进样器并需要较高的柱效时，才使用0.45mm内径的色谱柱。特别适用于高载气流速的情况，比如吹扫-捕集、顶空进样器和阀进样的应用。

    3、膜厚

    色谱柱液膜厚度影响保留、分离度、流失、惰性和柱容量。

    0.18-0.32mm内径的色谱柱平均或标准膜厚为0.18-0.25?m，可用于大多数分析；

    0.45-0.53mm内径的色谱柱平均或标准膜厚为0.8-1.5?m

    薄液膜色谱柱用于降低高沸点、高分子量溶质的保留（如，类固醇、甘油三酯）。

    厚液膜色谱柱惰性更好，柱容量更大，用于保留和分离挥发性溶质（如，轻质溶剂、气体）。