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分光光度计简单描述 光度计如何做好保养

时间:2020-06-28    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】727型分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长

727分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计的简单原理
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
 
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/mldsDNA37μg/mlssDNA40μg/mlRNA30μg/mlOlig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。
事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤%1A)。%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,,。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。

从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
 
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如 A 260 / A 280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品,比值大于DNA)(RNA)。如果比值低于,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于A 320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A 320 一般是 0
 蛋白质的直接定量(UV法)
 
这种方法是在280 nm波长,直接测试蛋白。选择 Warburg公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320 nm背景信息,设定此功能。与测试核酸类似,要求 A 280 的吸光值至少大于之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时,发现读数漂移。这是一个正常的现象。事实上,只要观察A 280的吸光值的变化范围不超过 1%,表明结果非常稳定。
 
漂移的原因是因为 Warburg公式吸光值换算成浓度,乘以一定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。
 蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA 的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。
 比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。
 比色方法一般有 BCABradfordLowry 等几种方法。
Lowry
法:以比较早期的 Biuret 反应为基础,并有所改进。蛋白质与Cu2+反应,产生蓝色的反应物。但是与 Biuret相比,Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTATriton x-100ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA
Bicinchoninine acid assay)法:这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生 Cu+,后者与 BCA 形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在 562 nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强,反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法,操作简单,敏感度高。但是与 Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
  Bradford 法:这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特点是,敏感度好,是 Lowry BCA 两种测试方法的 2倍;操作更简单,速度更快;只需要一种反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;而且与一系列干扰 LowryBCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。
 某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致,感到迷惑,究竟该相信哪种方法?由于各种方法反应的基团以及显色基团不一,所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如:Keller 等测试人奶中的蛋白,结果 LowryBCA测出的浓度明显高于Bradford,差异显著。即使是测定同一样品,同一种比色法选择的标准样品不一致,测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质,以 BSA 作标准品, mg / ml,以 a 球蛋白作标准品,浓度 mg /ml。因此,在选择比色法之前,可以是参照要测试的样本的化学构成,寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外,比色法定量蛋白质,经常出现的问题是样品的吸光值太低,导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是,反应后的颜色是有一定的半衰期,所以每种比色法都列出了反应测试时间,所有的样品(包括标准样品),都必须在此时间内测试。时间过长,得到的吸光值变小,换算的浓度值降低。除此,反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外,非常重要的是,可以是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯,因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色,导致样品吸光值不准确。
 细菌细胞密度(OD 600
实验室确定细菌生长密度和生长期,多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验,需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液,之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作,必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数,做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值,原因是采用了显色的培养基,即细菌培养一段时间后,与培养基反应,发生变色反应。另外,需要注意的是,测试的样品不能离心,保持细菌悬浮状态。
 分光光度计的重要配件 —— 比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积,有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白,均采用石英杯或者玻璃杯,但是不适合比色法测定。因为反应中的染料(如考马斯亮兰)能让石英和玻璃着色,所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。

 由于另外测试的样品量不同,所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量,亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯,样品用量仅需50μl,比色杯单个无菌包装,可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯,是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展,对此类科学的实验研究提出更高的要求,分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器,也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。 

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        原子荧光光度计利用惰性气体氩气作载气,将气态氢化物和过量氢气与载气混合后,导入加热的原子化装置,氢气和氩气在特制火焰装置中燃烧加热,氢化物受热以后迅速分解,被测元素离解为基态原子蒸气,其基态原子的量比单纯加热砷、锑、铋、锡、硒、碲、铅、锗等元素生成的基态原子高几个数量级。

利用原子荧光谱线的波长和强度进行物质的定性与定量分析的方法。原子蒸气吸收特征波长的辐射之后,原子激发到高能级,激发态原子接着以辐射方式去活化,由高能级跃迁到较低能级的过程中所发射的光称为原子荧光。当激发光源停止照射之后,发射荧光的过程随即停止。 原子荧光可分为 3类:即共振荧光、非共振荧光和敏化荧光,其中以共振原子荧光zui强,在分析中应用zui广。共振荧光是所发射的荧光和吸收的辐射波长相同。只有当基态是单一态,不存在中间能级,才能产生共振荧光。非共振荧光是激发态原子发射的荧光波长和吸收的辐射波长不相同。非共振荧光又可分为直跃线荧光、阶跃线荧光和反斯托克斯荧光。直跃线荧光是激发态原子由高能级跃迁到高于基态的亚稳能级所产生的荧光。阶跃线荧光是激发态原子先以非辐射方式去活化损失部分能量,回到较低的激发态,再以辐射方式去活化跃迁到基态所发射的荧光。直跃线和阶跃线荧光的波长都是比吸收辐射的波长要长。反斯托克斯荧光的特点是荧光波长比吸收光辐射的波长要短。敏化原子荧光是激发态原子通过碰撞将激发能转移给另一个原子使其激发,后者再以辐射方式去活化而发射的荧光。

根据荧光谱线的波长可以进行定性分析。在一定实验条件下,荧光强度与被测元素的浓度成正比。据此可以进行定量分析。 原子荧光光谱仪分为色散型和非色散型两类。两类仪器的结构基本相似,差别在于非色散仪器不用单色器。色散型仪器由辐射光源、单色器、原子化器、检测器、显示和记录装置组成。辐射光源用来激发原子使其产生原子荧光。可用连续光源或锐线光源,常用的连续光源是氙弧灯,可用的锐线光源有高强度空心阴极灯、无极放电灯及可控温度梯度原子光谱灯和激光。单色器用来选择所需要的荧光谱线,排除其他光谱线的干扰。原子化器用来将被测元素转化为原子蒸气,有火焰、电热、和电感耦合等离子焰原子化器。检测器用来检测光信号,并转换为电信号,常用的检测器是光电倍增管。显示和记录装置用来显示和记录测量结果,可用电表、数字表、记录仪等。 原子荧光光谱分析法具有设备简单、灵敏度高、光谱干扰少、工作曲线线性范围宽、可以进行多元素测定等优点。在地质、冶金、石油、生物医学、地球化学、材料和环境科学等各个领域内获得了广泛的应用。

原子荧光光度计的日常保养
 

       ● 严格遵循开、关机程序。

  ● 观察管路的密闭性能,如果管路漏液应及时停止转泵,查清漏源再次连接好管路,应及时清除漏液避免液体腐蚀仪器表面。

  ● 为了自身健康和环境请你及时处理废液。

  ● 测试完成以后,用去离子水清洗泵管和注射针管,并及时取下蠕动泵泵管卡,避免泵管长时间压制变形而影响其寿命。变形后可用10%盐酸浸泡48小时,用去离子水清洗干净备用。

  ● 泵管使用一段时间后,应随时向泵管与泵头间的空隙滴加随机提供的硅油,以保护泵管。

  ● 仪器的表面清洁 仪器的外壳表面经过了喷漆、及喷塑工艺的处理,在使用过程中请不要将溶液遗洒在外壳上, 否则会在外壳上留下斑痕, 如果不小心将溶液遗洒在外壳上请立即用湿毛巾擦拭干净,杜绝使用有机溶液擦拭。

  ● 气液分离器和加热石英管为石英玻璃件,应避免碰撞以免破碎,使用过程中可用10%盐酸浸泡24小时来清除杂质,用去离子水清洗干净晾干备用。

  ● 仪器长期不用时,需每隔1个月预热仪器半小时左右(在测量状态下预热才有用),有助于延长灯及仪器的寿命。

 以上资料由 武汉中昌国研标物科技有限公司 整理发布。

原子荧光光度计的故障问题

  一、原子荧光光度计点火问题:

  在分析工作中,经常会碰到部分仪器点火线圈不亮,无法正常点火。首先要检查点火炉丝是否正常,如炉丝断则需要更换炉丝,如炉丝亮但点不燃火焰,就需要检查燃气或控制阀,检查炉丝与炉芯的位置是否合适。排除这些故障后仪器可正常点火。

  二、原子荧光光度计无信号强度:

  在仪器检定过程中,经常遇到仪器测量标准溶液后无响应荧光强度。遇到此类问题,首先应该检查静态光源,检查元素灯是否点亮。若仪器灯能量正常,说明仪器电路部分正常,则需要进一步检查反应系统或原子化系统。检查仪器泵管松紧是否合适,管道有无堵塞破裂。如出现上述情况,试剂没有进系统,仪器没有发生氧化还原反应,则不会产生信号。更换管道,调整泵管松紧可以解决此问题。

  检定标准溶液的酸度或还原剂浓度不够,不能生成被测元素的氢化物,无法正常原子化也会造成仪器无响应荧光强度,这就需要检查配置标准溶液所使用的酸和还原剂浓度。

  三、原子荧光光度计性能特点:

  1、适用于样品中砷、汞、硒、铅、锗、锡、锑、铋、镉、碲、锌、金等十二种元素的痕量分析。

  2、首创采用zui新设计的进口注射泵与蠕动泵联用的内置式断续流动进样装置,即保证进样量准确,

  又克服了注射泵腐蚀和漏液的现象,同时样品和空白交替引入,在线清洗,机械动力排除废液,杜绝交叉污染,节约样品和试剂用量。

  3、首创夹管阀应用技术,代替传统的单向阀和多道通阀,试剂不接触阀体,无腐蚀,无记忆,且可靠性高,寿命长达50万次以上。

  4、全自动智能化运行,三维自动进样器,单个样品盘多达130位,并支持半自动测定方式。

  5、采用特制编码空芯阴极灯,仪器自动识别元素,并可监控空芯阴极灯使用寿命。

  6、空芯阴极灯采用恒流驱动、脉冲供电方式,提高其发射强度和效率,延长其使用寿命。

  7、仪器可实现单点配制工作曲线,自动稀释高浓度样品。

标签: 原子荧光光度计
原子荧光光度计 原子荧光光度计的故障问题_原子荧光光度计

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