荧光的原理是某些物质会在高强度的短波长光线照射下，会发出波长稍长的发射光（荧光）。而我们一般都是观察被激发荧光基团所发射出来的波长稍长的发射光（荧光）。

　　但是激发的光会很强，所以我们就需要把激发的光全部滤去，这样才可以看到荧光基团的发射光（荧光）。

　　荧光显微镜一般都用高强度的汞灯做激发光源。使用滤色片把不需要的光滤去，只留下激发荧光集团的高强度很纯的光线。这个单色的光线通过物镜照射到样本上之后，样本会被激发出发射光（荧光），荧光和激发光都会沿着物镜光路返回，这样的话，就需要用一个二相色镜把激发光滤去，只让我们需要看到的荧光透过。

 

　　这个荧光沿着显微镜的光路最后到达目镜下，然后进入我们的眼睛，我们就可以看到荧光基团所发出来的荧光了。

　　荧光显微镜的预检查和调节：

　　(1)每次进行荧光观测前，必须例行检查荧光装置的灯丝对中、光路对焦、孔径光阑、视场光阑设置等状况。

　　(2)所需要的荧光激发/发射滤光片组件是否已装在转换器中，荧光显微镜物镜配置是否得当，除去物镜前透镜的油渍和灰尘。

　　(3)如同时进行透射光相差观察，要检查聚光镜对中心及相差环与物镜相反的共轭情况。

　　(4)检查样品载体(载玻片、盖玻片和其他器皿)有否挂有液体、灰尘，厚度是否在物镜标定的工作距离范围内。切片样品不能太厚，约≤10μm为宜。

　　(5)因照明光源含有紫外线，在载物台前上方放一块棕色遮光板，以防紫外线损伤视网膜。

　　(6)电压不稳会降低高压汞灯的使用寿命，光源电源加配稳压器。

　　(7)为延长汞灯寿命，在开启后15min方可关闭；汞灯荧光电源一旦关闭，再次启动至少需等待10min，以使水银蒸汽冷却复至原态，否则会影响灯的寿命。

　　荧光显微镜的像观察：

　　(1)在开启荧光灯源后约5～10min激发光强度趋于稳定，装载样品进行观察；为防止在调焦和寻找物像过程中过度激发光照会造成样品荧光淬灭，先通过缩小荧光显微镜的孔径光阑或加ND滤光片将激发光调节到适度强度，有规律地移动样品台，待确定镜像后，在调节到荧光状态用于拍摄记录。

　　(2)镜像质量不佳的调整。排除样品制备因素外，可进行的必要调节措施是：

　　①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND滤光片等。

　　②重新调节荧光显微镜的收光器对焦和孔径光阑大小。

　　③细心调节荧光显微镜物镜覆盖差校正环。

　　荧光显微镜的应用要点

　　荧光显微镜是利用“光化荧光”成像，如果所选激发波长在肉眼所看不见的近紫外光区(320～400nm)，荧光的发射光谱也较普通光镜光源的平均波长短，光学分辨率提高。高能量的光子与电子碰撞，使得电子从基态跃迁到激发态。激发态的电子很不稳定，会重新回落到基态，这个过程中会消耗部分热能，并发出新的光子。新的光子能量比起初的光子能量低，因此波长更长。由于新的光子波长区别于入射光的光子波长，通过一定的光学处理方法将两束不同波长的光分开，从而使我们只看到发射出来的新光子（荧光信号），也就是荧光显微镜看到的荧光图像。

荧光显微镜 荧光显微镜的原理及应用如何？_荧光显微镜 　　生物显微镜是用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等的观察和研究，同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。左图所示为生产的倒置生物显微镜型，该生物显微镜也是食品厂、饮用水厂办QS、HACCP认证的必备检验设备。

　使用方法

先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在zui高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，整理增加明暗差。


生物显微镜是由精密的机械和光学镜头组成的，由于各种材料热膨胀系数不同，所以显微镜不能在阳光下曝晒，也不能放在靠近火炉和暖气的地方。只能室温存放，其工作的温度范围一般为5℃～40℃。

　二、生物显微镜防潮

生物显微镜如果长期受潮，透镜很容易发霉，表面还会腐蚀，所以应在干燥环境下保存。在31℃时湿度不得>80%，温度每升高3℃，相对湿度要设法降低10%。

　三、生物显微镜防尘

生物显微镜灰尘不仅会影响成像质量，而且灰尘中往往也带有含酸、碱等腐蚀性的尘粒，容易腐蚀镜面。而硬度大的尘粒在擦拭镜头时还可能在镜面上划出伤痕，损坏镜头。此外，灰尘掉进机械活动部分时容易造成机械部分转动不灵活，甚至损坏。

　四、生物显微镜防腐蚀

生物显微镜不可与腐蚀性酸类、碱类或挥发性强的化学药品放在一起，以免被腐蚀，缩短使用年限。原则上，当观察含液体的标本时，一般都要盖上盖玻片；若液体中含有酸、碱等腐蚀性化学物质时，应把盖玻片的四周用石蜡或凡士林封住，然后观察。但由于进行中药显微鉴定时，经常要用这一类试剂，不可能都封固，因此要特别小心，防止液体流到载物台上，更不要沾到物镜上。

五、生物显微镜防震

生物显微镜是精密仪器，剧烈的震动会造成精密度的降低。要轻拿轻放，搁置要平稳，使用时动作应轻柔。

六、生物显微镜擦拭

1、机械装置的擦拭

机械装置如有污渍，可用干净的柔软细布擦拭;如果擦不掉，可用擦镜纸或细绸布蘸少量二甲苯擦拭。应注意不能用酒精、乙醚等化学品，以免腐蚀装置表面的油漆。拭去锈和油腻(不得用乙醇，因为这些溶剂会侵蚀油漆)，再用少许液体石服润滑；旋扭过紧不要强行扭动，以免损坏。

2、光学镜头的擦拭

一般采用先吹、后刷、再擦拭的方法。吹，就是用吹气球(或用洗耳球)吹掉镜头表面的附着物，但不能用口直接吹气。吹不掉时，可用干净的专用清洁毛刷轻轻地刷。经上述两种方法处理后镜头表面仍有污物时，用擦镜纸稍蘸一点二甲苯轻轻擦拭。如果发现镜头发霉长雾时，可用擦镜纸蘸少许无水酒精和乙醚的混合液擦拭，但液体不能太多，停留时间要短，以免渗入镜头内部造成腐蚀。 油镜头每次用过后要及时擦拭，先用干擦镜纸擦一两次，把大部分介质油去掉，再用二甲苯滴湿擦镜纸擦两次，zui后再用干擦镜纸擦一次。

　　七、生物显微镜其他

(1)、生物显微镜光学镜头表面不可用手触摸，以免污染。具有张力作用的器件使用完毕后要让它回到自然松弛状态。任何可调节的部位都不要让它处于极端位置。电源开关不要短时内频繁开关。显微镜使用间歇中要调低照明亮度。

(2)、决不可把标本长时间留放在载物台上，特别是有挥发性物质时更应注意这一点。

(3)、在每次关闭显微镜电源之前．应该把显微镜灯光由亮调至zui暗。关闭显微镜电源后．须等灯箱完全冷却之后(大概20 min)再罩上显微镜防尘透气罩。开启显微镜电源后，先将显微镜灯光调至zui暗，以免损坏灯泡和电子元器件短路。

(4)、虹膜应该经常注意避免生锈和油淬火,有点酸免费凡士林或必要时油提取溶解脂肪陈后再抹拭干净的油。

(5)、齿轮齿条的油、油脂和滑槽面——死一整天灰尘、污垢或硬化,硬厚旋转手轮,去除脂肪陈二甲苯可用,然后穿上一点凡士林,没有酸动物脂肪或酸,不与其他任何油,以免影响仪器。

(6)、物镜的内部应定期检查,与虎皮吹灰规模（耳朵注射器）。在必要的时候仔细抹拭,抹拭镜子用棍子（一些棉花球或纸轻轻抹拭,在必要的时候,可以用一个小蘸油香精或二甲苯,zui后与污垢。