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选择液相色谱柱要考虑哪些因素 液相色谱常见问题解决方法

时间:2020-06-29    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】色谱柱是运用于色谱仪系统中起着分离作用的仪器,是色谱仪分析系统的核心部件,色谱柱柱效的高低影响着检测速率的快慢以及检测结果的准确性。因此,为了提高色谱柱



    色谱柱是运用于色谱仪系统中起着分离作用的仪器,是色谱仪分析系统的核心部件,色谱柱柱效的高低影响着检测速率的快慢以及检测结果的准确性。因此,为了提高色谱柱的柱效,保证液相色谱仪分析检测的灵敏性,了解液相色谱柱的选购技巧尤为重要。

    选择液相色谱柱时需要考虑的主要因素包括:键合相、粒径、孔径、碳载量,下面来一一介绍:

    1、键合相:

    确定了正反相后基本就简单了,正相很简单,我们重点讨论下反相,C18主要分离非极性和弱极性物质,因为是键合硅胶,所以C18也分好几种有常规的如C18-A,耐纯水的OLAppleC18-AQ、耐酸碱的OLAppleC18-EX等,如果发现C18保留很弱,调整流动相也不行,这个时候可以考虑C8甚至C4等。

    2、粒径:

    色谱法追求的是高效、高分辨、高速等。目前来说亚2um填料或者2UM核壳填料是很理想的模型,基本具备“三高”特征尤其是高速,线速度不在影响分离度,不过附带的缺点就是高压,要升级相应的硬件,成本高昂,需要谨慎考虑。5um填料比较普遍,目前来说完全可以胜任各种日常检测,即使有特殊要求,3um色谱填料基本上也能全覆盖,不过该模型下线速度和分离度是成反比的。

    3、孔径:

    目前很多60~300A都有,甚至更高或者更低的。开孔的填料多了个类似分子筛功能,所以选择孔径一定要关注分子量,蛋白(分子量5000以上)一般都需要在160A以上,多肽(分子量上限在3000左右)在120A左右,一般快速柱孔径都很小,可以缩短样品路径。所以国际上还有无孔硅胶柱子,也很适合蛋白分离,彻底解决蛋白分子量大和太粘稠堵住孔径问题。

    4、碳载量:

    快速柱碳载量很低,如A家等,省时间,省溶剂,但分析部分复杂样品如中药等有点力不从心,这个时候可以考虑英国OLApple色谱柱,碳载量15~23%,碳载量数值就像河床的水草,越高代表越密集,保留样品能力越强,越有可能分离开难分离物质。





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  现代液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择中。但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解。
 
  硅胶基质填料:
 
  1、正相色谱
 
  正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团(ZH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。
 
  由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性教强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强落的组份zui先被冲洗出色谱柱。
 
  正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯(Chloroform)二氯甲烷(Methylence Chloride)等。
 
  2、反相色谱
 
  反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对教弱的官能团的键合相。
 
  反相色谱所使用的流动相极性教强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。
 
  样品流出色谱柱的顺序是极性教强组合zui先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。
 
  常用的反相填料有C18(ODS) C8(MOS)。C4(B)C6H5(Phenyl)等。
 
  聚合物填料:
 
  聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等,其主要优点是在PG值为1-14均可使用。
 
  相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的淑水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。
 
  现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效教低。
 
  其他无机填料
 
  其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质,一般于特殊的用途。如墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用,新型氧化诰填料也可用于 HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化诰微球色谱柱,应用PH范围1~14,温度可达到1000C。由于氧化诰填料几年才开始研究,加之前的实验难度,其重要用途与优势尚在进行中。
 
  怎样选择填料粒度
 
  目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3,5和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是*的因素。如果固定相选择是真确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料是很用有的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5UM填料的柱效提高近30%;然而;3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。
 
  如何保证良好的柱性能与柱寿命
 
  认证阅读色谱柱使用说明书
 
  使用填充良好的色谱柱
 
  尽量减少压力波动,避免机械及热冲击
 
  使用保护柱及在线过滤器
 
  经常以强溶剂冲洗色谱柱
 
  充分过滤样品及流动相,尽量避免杂质微粒与保强留分成
 
  用稳定的固定相(C18zui稳定)
 
  在中等PH纸操作(6~8),用有机年成液溶
 
  色谱柱使用温度小于400C
 
  硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0
 
  在水流动相与缓冲浓液中加200ppm的叠氮钠
 
  流动相中含有缓冲溶液,应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡,有机溶剂不能低于5%
 
  过夜或储存时,冲洗掉盐和缓冲液,用纯有机溶剂流动相保存(乙晴)

液相色谱仪进样器的选择

  早期使用隔膜和停流进样器,装在色谱柱进口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器

  进样装置要求:密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为:隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

  1.隔膜进样。

  用微量注射器将样品注进专门设计的与色谱柱相连的进样头内,可把样品直接送到柱头填充床的中心,死体积几乎即是零,可以获得较佳的柱效,且价格便宜,操纵方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上);此外隔膜轻易吸附样品产生记忆效应,使进样重复性只能达到1~2%;加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到,常规分析使用受到限制。

  2.停流进样。

  可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”;另一缺点是保存时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中,效果较好。

  3.阀进样。

  一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国Rheodyne公司的7725和7725i型常见),其关键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。由于阀接头和连接管死体积的存在,柱效率低于隔膜进样(约下降5~10%左右),但耐高压(35~40MPa),进样量正确,重复性好(0.5%),操纵方便。

  4.自动进样。

  用于大量样品的常规分析。

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