安捷伦液相色谱仪的安装 液相色谱如何做好保养

    安捷伦液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

    第一：安捷伦液相色谱仪安装条件：

    一、环境要求：

    1、温度：15～30℃

    2、日温差：±3℃

    3、相对湿度：20%～85%

    4、地面：平滑、不易起尘

    5、安装场所：无震动、周围无腐蚀性介质、无电磁场干扰，操作台纵深尺寸60cm以上，避免空调直吹风，避免直射阳光。

    6、推荐液相色谱仪工作台：长2米、宽0.8米，承重大于80公斤。建议离墙距离0.3米以上。

    一般在安装的实际空间上，还要考虑：

    与其它仪器间距大于60cm，仪器后面板应留有不小于50cm的空间，前面板至操作台边缘距离不小10cm；仪器安装平稳牢固，接入了UPS电源，仪器外壳与地线连接。

    二、电源要求：

    1、单相交流220V，(+5%～-10%)，50～60Hz，有单独的良好接地。

    2、若电压不稳，需配置稳压电源，功率大于2.5千瓦。

    3、准备1个合格的万用接线板，总数不小于5个扁平三角接线插座。

    4、断电续电能力：断电情形，设备能持续运行1小时以上。

    5、接地：安装场所应有可靠接地线装置

    三、溶剂要求：

    1、二次重蒸馏水，1000毫升以上(建议用0.45微米水相滤膜过滤)。

    2、乙腈或甲醇(色谱纯或优级纯)，1500毫升以上(建议用0.45微米有机相滤膜过滤)。

    四、操作系统：WindowsXP操作系统

    硬件要求：内存不低于2G；硬盘不低于160G；配有网络适配器（2个网卡）；带光区驱动

    第二、安捷伦液相色谱仪安装方法：

    1、液相色谱柱的结构：

    a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

    柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。

    在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

    b、柱填料：

    液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

    正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

    反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

    常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10μm之间。

    2，色谱柱的安装：

    a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。

    b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

    c、按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。

    第三、液相色谱柱的使用：

    色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

    1、样品的前处理：

    a、可以使用流动相溶解样品。

    b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

    c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

    2、流动相的配制：

    液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

    a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

    b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

    c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

    d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

    e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

    f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

    3、流动相流速的选择：

    因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求较佳柱效，可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

    当选用较佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

    注意：

    a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

    b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水可以使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

    c．含水流动相可以在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要放置时间过长。可以加入叠氮化钠，防止细菌生长。

    d．流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

    e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

    4、柱性能测试：

    启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为1ml／min。

    b、UV检测器波长设定为254nm。

    使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

    记录并计算测试结果。

    色谱柱用久后常出现柱压升高，柱效降低，峰形畸变，保留时间改变等变化，如不采取适当措施，色谱柱将无法再使用，缩短色谱柱的使用寿命。在高效液相色谱仪的使用中，保持高效液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性，延长柱子的使用寿命非常重要。

    1、流动相对色谱柱的损害因素

    颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下，微小的颗粒杂质很容易使柱子发生堵塞，因此使用的溶剂应当过滤，柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻挡颗粒物进入柱中。

    水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时，应防止细菌的生长，五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时，一些厌氧霉菌可能在色谱柱中滋生，堵塞固定相颗粒间的空隙。

    pH值:对硅胶基键合相填料，水溶液pH值不可超过2-7.5这一范围，当pH>8时，硅胶会释出

    生成絮状物堵塞柱子，且难以复原，柱效很快降低，甚至完全失效。

    盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时，其中的盐类溶解度下降，可析出盐类沉淀，堵塞柱子;加入粘度不同的样品溶液也可能发生类似现象。所以缓冲液中盐的浓度宜低，样品提取液的组成应和流动相匹配。

    2、样品对色谱柱的损害因素

    杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞，样品也应进行过滤处理。

    样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等，可以采取加装保护柱，或使用适应的溶剂反冲来处理。常用溶剂有四氢呋喃(适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油)、高浓度的脲或盐酸胍溶液(使蛋白质改性而洗脱)、高离子强度的磷酸盐缓冲液(pH=7，适合反相柱和离子交换柱，可除去蛋白质和醣等)。

    样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重，NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点，使保留时间缩短，因此羰基化合物样品和流动相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。

    活性点被覆盖:由于固定相吸附样品中的组成或杂质而使活性点被覆盖，在柱压升高的同时保留时间减少，将样品过滤或使用萃取分离柱(对大分子有机物如蛋白质、白细胞等)效果较好。

    3、色谱柱固定相的化学变化

    色谱柱固定相分解、活性基团变性以及键合相基团脱落会使保留时间显著变化。

    1、键合相基团脱落

    绝大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上，形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为、G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂，使键合相基团脱落，对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落，可增加流动相的有机溶剂量，降低离子强度和pH值，对基团已脱落的固定相，可用合适的硅烷试剂再生。

    2、固定相分解或活性基团变性

    例如氰基柱的保留时间显著缩短，但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化，证明未发生—CN水解成-COOH反应，而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。

    4、高效液相色谱柱的保养

    色谱柱在使用一段时间后，常遇到柱子受污染，柱效下降的问题，采用适当的方法对色谱加以保护和再生，能够延长色谱柱的使用寿命。