烟草中的水溶性糖,特别是还原糖是影响烟草吸味的重要化学成分之一,目前烟草中的还原糖和总糖的测定方法主要有氧化还原滴定法,分光光度法,连续流动分析和高效液相色谱法等。液相色谱法是较为可靠的方法,但其样品前处理比较麻烦,且流动相和提取溶剂的不一致会导致示差折光检测器有很大的溶剂峰而干扰分析。我们首次用WatersSugar-Pak1钙型阳离子交换柱分离测定了烟草样品中的4种糖,并建立了用水超声浸取,固相萃取预分离的样品前处理
方法,获得了满意结果。
主要仪器和试剂 高效液相色谱仪
色谱条件 色谱柱
流动相为: 0.05 g/L EDTA
样品处理
准确称取烟草样品约0.500 g,用50 mL水在40~50℃下超声萃取40 min,过滤,弃去最初的约10mL滤液,收集后面的滤液。取5 mL滤液通过预活化好的Sep-PakC18固相萃取小柱,弃去最初的2 mL,收集后面的3mL用4.5μm滤膜过滤,取20μL进样分析。
结果
实验条件选择 实验选用示差折光检测器检测。钙型阳离子交换柱为分离糖和多羟基化合物专用柱,该柱用0.05g/LEDTA钙钠水溶液作流动相,柱温要求控制在80~90℃之间,实验选用85℃。
样品前处理 由于4种糖都易溶于水,所以实验选用水超声浸取的方法,室温下糖溶出慢,升高温度可加速糖的溶出,但温度过高（超过60℃）会加快多糖,蔗糖和麦芽糖水解;故实验选择浸取温度40~50℃,在该温度下超声浸取30min以上可使糖完全溶出,实验选用超声浸取40min。糖提取液可以当天测定,如放置过夜会导致葡萄糖测定结果稍有偏高。
烟草样品提取液中除了糖外,还含有少量其它杂质成分,会污染色谱柱而降低柱效,所以在进样之前要预分离这些成分。我们采用Sep-PakC18固相萃取小柱预固相萃取和用Sep-Pak Alumin Cartridges保护柱在线分离可有效地除去杂
质成分。
用钙型阳离子交换柱高效液相色谱法测定烟草样品中的糖,并用水超声浸取提取样品中的糖,方法简便快速,结果可靠,样品可实现批量处理,可满足大量样品分析的要求,提高了工作效率。方法用于几种烟样分析,各糖回收率在96%~104%之间,相对标准偏差在0.98%~1.36%之间。结果令人满意。
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一、液相色谱理论发展简况
色谱法的分离原理是：
溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从定相中流出。又称为色层法、层析法。
色谱法比较早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点
HPLC有以下特点：
高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到较佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
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造成柱压升高的原因很多。一般是由于柱床内产生了异常的占位性物体，造成流体阻力加大所引起的。
1、流动相过滤不良
因机械性杂质堵塞进口滤片，导致压力升高。这往往是由于流动相没有过滤，或虽已过滤但滤膜孔径过大或滤片损坏，使固体杂质滞留于滤板上所造成的。湿度传感器探头,不锈钢电热管PT100传感器,铸铝加热器,加热圈流体电磁阀
2、霉菌生长
霉菌在流动相中、管路中或柱子进口处繁殖、生长堵塞滤板，导致压力升高。这种现象在夏季，尤其是使用磷酸盐缓冲液为流动相时更易发生。在夏季使用磷酸盐缓冲液时一般要现配现用。即使保存在冰箱中，一般也不要超过两天。否则，即使不堵塞滤板，也会因细菌或霉菌孳生产生代谢物而造成对样品分析的干扰。
3、非特异性吸附
当溶质在柱子上有较强的非特异性吸附，且当前所用的流动相难以将它们洗脱时，累积的未洗脱溶质也会造成阻力增大和压力升高。
4、更换流动相时置换不彻底
当改换流动相体系时，不彻底的更换使不同性质、互不混溶的流动相存在于一个体系之中，也会造成压力升高。
5、盐晶体的析出
使用缓冲液或添加有缓冲液的流动相后，缓冲液中的无机盐成份可能会残留在体系之中。它们会因在新流动相体系中的溶解度降低而析出，造成流体阻力加大、压力升高。
6、样品的沉淀
当样品所使用的溶剂与流动相不一致时，样品进入柱中有时可能因溶解度降低而沉淀出来，造成压力升高。
7、压力脉冲
运行过程中，有时会产生系统内压力的突然升降。例如，转动进样阀时动作过缓，造成液流堵塞后再瞬间释放;开机瞬间压差较高等。如此所形成的压力脉冲会造成多孔填料的崩坏和柱床结构的微小变化。填料微屑的长期积累也可能会使柱床阻力增大。
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