色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。关于色谱柱的安装、维护、保存以及由色谱柱导致的这样那样的色谱故障也是一门学问。高效液相色谱柱的正确使用包含：加装保护柱，过滤流动相和样品，净化样品，避免过高的柱压，注意温度和酸碱度，正确及时的冲洗等。

    1.加装保护柱
    保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污染,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。
    保护柱填料应与分析柱一致,粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品,经过一定次数的样品分析(5～1次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。
    2.过滤流动相和样品
    流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。
    当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。
    所配制的样品试液在注入流路系统前均要经.45μm(.22μm则更好)孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系,二者不可混用,以防止滤膜溶解而造成污染。
    装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换,以避免滤器因过载而起不到过滤作用。
    3.净化样品
    当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分,如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。
    4.避免过高柱压
    虽然高效液相色谱柱能耐受的压力可达6psi(磅/平方英寸),但过高及过大的压力变化均会缩短色谱柱的寿命,避免的方法是
    (1)柱压过高时,尽可能采用较小的流速,以不超过柱最大允许压力的一半为宜。
    (2)当流速较大时,应采取流速梯度的办法使流速分步到位。
    (3)使用手动进样阀时,进样阀的切换要尽可能的快。否则超过2%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,柱切换要避免在高压下进行。
    5.注意温度和酸碱度
    一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过6℃,以低于4℃为宜,特别是在流动相pH接近使用限度时,更应降低使用温度。
    温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解,从而使填料性质改变,柱床塌陷,降低柱效,改变峰形。
    目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达2～1,但在实际使用时应避免极端的pH条件,特别是在偏碱性的条件(pH≥8)下使用,如必须要在极端的pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害:
    (1)在泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相
    (2)降低使用温度
    (3)检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的“温和溶剂”彻底清洗。
    6.正确及时的冲洗
    开始试验前,应了解柱中当前是何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。

    高效液相（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的。和其它分析一样，你若想让HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。

    一、脱气

    流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC系统内是不希望有气泡存在的。HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。

    当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。

    紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。

    所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE管）渗透进流动相中。

    如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种：

    1. 吹氦脱气法。利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa压力下，以约60 mL/min流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。

    2. 加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。

    3. 抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。

    4. 超声波脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡10～20min。此法的脱气效果最差。

    5. 在线脱气法。现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。建议购买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。

    二、过滤

    任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。在HPLC系统中，颗粒物的主要来源有三个途径：流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。

    1、流动相

    如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 μm微孔滤膜过滤。同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2 μm微孔滤膜。然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗粒。在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中成为残渣。

    流动相通过0.45 μm微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效方法。0.2 μm微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45μm微孔滤膜更有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的质量不太好时。建议实验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验室的规定，即：

    流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使用前必须过滤。

    在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。这个过滤器的规格为≥10 μm的微孔物质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。

    2、被测样品

    液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。一些实验室在将他们的样品放置在自动进样器盘（或手动进样）以前，所有样品都先通过一个0.45 μm针筒式过滤器过滤。这是一个有效除去被测样品中颗粒物的方法。但是这个过程也有一点需要关注：你使用了针筒式过滤器就不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会有或多或少的丢失。丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。如果有丢失，过滤后液体中被测物的含量或浓度与原基本样液的含量或浓度还相同吗？这个问题一般需要通过实验确认。确认这步是要增加工作量和费用的。过滤器的使用是一种消耗，每个过滤器的价格从几元到十几元。但在做食品中残留物分析时，由于基质大多比较复杂，所以过滤这步已成为不可或缺的一步。在实际分析工作中，一般检测每一组样品会带一个外标、一个添加回收或是质控样品，所以，只要最终检测时得到的信噪比能满足检出限要求，可将这步视为系统误差而忽略。

     3、系统部件的磨损物

    最后，在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。

    第一种建议认为，在一般实验室中输液泵密封垫通常使用寿命为六个月到一年，因此建议半年或一年更换这些密封垫，实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。该观点认为：与输液泵密封垫颗粒堵塞柱子而更换新柱子的费用相比，更换密封垫的费用低些。一些输液泵有玻璃砂芯或筛网，可在流路中滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，防止这些颗粒物随流动相流至柱头。若有这种装置应查阅输液泵操作手册，查看推荐的这种过滤器清洗或更换的间隔。

    另一种建议则认为，原装密封垫的密封效果可以，更换以后容易引起流动相渗漏。所以，只要不漏液就不要轻易更换密封垫。

    两种说法都有其道理，具体如何操作，建议与仪器公司工程师沟通，各公司的仪器还是有些不同的。

    自动进样器旋转轴的密封随着使用时间也会磨损，但是在我的经验中，即便是高负荷的运转旋转轴密封垫也可以使用几年。如果你的自动进样器系统有计数进样阀转动次数的功能，你可以设定一个警铃当预设阀转动次数已达到时提醒你。曾有一种说法，进样器较多转动20，000次，这仅仅是进样10000个；但这似乎不是实验室涉及的常规样品分析使用寿命，它们的实际使用寿命会更长。旋转轴密封磨损后会渗液，比较明显的特征是同一样品多次进样后，峰面积值差别比较大（RSD》5%）。当然，输液泵的密封垫和旋转轴的密封垫磨损将增加更多研磨物在流动相中，加速对这些部件的损伤。此外，如果你日常运行的流动相有缓冲盐，如磷酸缓冲盐，密封垫的磨损会更快。

    无论颗粒物源于何物，实验时都要将其除去。推荐在HPLC系统中采用一个0.45或0.5 μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如采用一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又方便（几分钟就可更换）。若采用在线过滤，HPLC系统检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升一定值，例如25%或增加500psi，应该更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。

    三、冲洗

    使HPLC系统良好运行的第三个要点是保持系统的清洁。你需要关注流动相流经该系统的所有地方，对于这些地方经常性的冲洗，将使你的系统保持在“Ready”状态。

    1、流动相储液瓶

    首先要经常清洗流动相储液瓶，或者每做一批新样品更换一次流动相。一个脏的储液瓶将会污染注入的流动相。建议储液瓶中缓冲液使用时间不要超过一周，而有机溶剂使用时间不要超过一个月。也有人建议储液瓶中保持用溶剂充满，直到更换分析方法储液瓶需更换新溶剂（流动相组成发生变化）时，将旧溶剂倒掉更换新溶剂，这样胜于将溶剂用完。但这对于分析样品量少的实验室而言似乎有些浪费。仪器公司的工程师建议储水瓶的水要天天换，每周瓶子还应该用异丙醇清洗一次。有的实验室则在水里加入0.1～1 mM的甲酸抑制微生物的生长。这些做法看起来有些繁琐，但却能起到“磨刀不误砍柴工”作用。

    2、泵

    接下来要冲洗的是泵。千万不要一分析完冲几分钟后就停泵，特别是当流动相中含有难挥发的缓冲液（如磷酸盐）时。如果仪器不是连续使用，当流动相蒸发时，难挥发物就会粘在活塞密封垫的表面，难挥发物将形成固形物沉淀。这是泵密封垫磨损和单向阀渗漏的主要原因之一。所以，无论使用长短，在停泵以前一定要用非缓冲液流动相冲洗泵在半个小时以上，要是流动相中有难挥发缓冲盐则建议冲洗的时间应该更长些。

    3、自动进样器

    自动进样器也要按规定清洗。现在的仪器多配有自动进样器的冲洗液瓶，通常只要注意及时更换、补充冲洗液即可。自动进样器用的洗涤液也要采用与流动相相同的方式处理，并根据溶剂的有效期和规定，清洗储液瓶或更换洗涤液。现在的自动进样器设置、操作都很简单，如果时间允许（特别是利用夜间运行），每次分析完后设置进1、2针纯溶剂（如甲醇、乙腈），也是一个好做法。

    4、色谱柱

    对柱子的污染是随使用时间而增加。通常表现是：运行走基线时在记录的色谱图中基线噪音增加，泵压也增加。解决这个问题的比较为有效方法就是在每一批样品分析结束后或准备卸下柱子时用大量的流动相冲洗柱子（例如，甲醇、乙腈和水）。用梯度冲洗效果更好，具体的比例要根据柱子的说明书和性质而定。

    5、检测器

    如果是正常使用，检测器将依据其性质并按照说明书规定进行洗。例如UV/VIS检测器或FL检测器，在对柱子和系统进行冲洗时也就一同对检测器流通池中污染物进行了清洗。但是蒸发光检测器或则需要按照说明书进行定期清洗。这些检测器在使用时会有难挥发污染物沉积，如质谱仪离子源的喷针、毛细管、锥孔板、预四极等部件，因而需要定期清洗。而且对联有这些检测器的系统冲洗时，可以与这些检测器断开，以减少对检测器的污染。

    总之，实验室日常使用的液相要是能认真做好这三项工作——脱气、过滤和冲洗，你的仪器可以得到良好的预防性维护，使用时就会感到比较顺手。当然，在实际操作时遇到的问题并没有这么简单，但这三个良好习惯将是正确操作、使用HPLC系统的基础。