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液相色谱柱的安装 液相色谱如何操作

时间:2020-07-02    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的



    液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
    液相色谱柱的安装:
    1、液相色谱柱的结构:
    a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
    柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。
    在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。
    b、柱填料:
    液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。
    正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 ?m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
    反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
    常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 ?m之间。





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  【仪器网 使用手册】制备型液相色谱仪目的是对产品的单体进行提取和纯化,与蒸馏、萃取等纯化方法相比制备型液相色谱法更有效,但对操作的要求也更高。为保证制备型液相色谱仪可以达到理想的实验效果,需要谨慎选择操作条件,减少影响分离效果的因素。
 
  色谱柱的选择
 
  色谱柱的容量有一定限制,每种色谱柱都有自己的负载能力,因此样品的导入值上限需要根据所用的色谱柱确定。色谱柱与大样品量的关系如下:
 
  1.色谱柱内半径越大,柱子的负载能力越高。
 
  2.分配系数K增加,柱子的负载能力也会增加。同时,溶质的保留体积同样也会增加。
 
  3.色谱柱的填充方法影响着填充密度,用良好方法填充的柱子密度趋近它的大值,柱子的样品量和分辨率同样也会趋近大值。
 
  4.采用表面积大的吸附剂虽然会减弱色谱系统的速度和适用范围,但可以增加柱子的负载能力。
 
  5.柱子的负载能力还随着柱子的长度增加而增长,但柱子过长会损失柱效。
 
  6.填料颗粒的大小与柱子负载量也呈正相关关系。
 
  样品的溶解
 
  样品在溶剂里的溶解度会影响注入的大样品量。在流动相里难溶解的物质通常不能充分分离或分辨率比较低,因此需要先将样品溶解在另一种溶剂中,再将这种溶液送人色谱分离系统。中间溶剂的选择很重要,并且需要经验。
 
  流动相的纯度
 
  流动相的纯度与样品中的纯度息息相关。在分离组分特性相近或痕量组分时,流动相里的杂质还可能污染色谱柱,影响分离效能。因此流动相须保证纯净。
 
  流动相的流速
 
  流动相的流速与分离速度、分离效率相关,流速越快分离速度越快,但分离效率越低,因此需要选择合适的速度保证速度与效率并重。
 
  固定相的选择
 
  为了分辨效果,应尽量选择吸附色谱。从填料的容量看,全多孔型比表面多空型好;从固定相微粒的大小看,30~50μ较常用。
  液相色谱仪是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异,对混合物进行先分离,而后分析鉴定的仪器。
  
  现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较,具有、快速、灵敏等特点。一台品质优良的液相色谱系统应从以下几个方面考虑:
  
  一、主要技术指标优异:
  
  首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多,有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要技术指标,根据国家标准,仪器的主要指标有噪音,漂移,zui小检测浓度,定性定量重复性等。这些指标都要放在系统,回路里去看,去比较。就是需要把各单元装置都要联接好,如接好色谱柱,进样阀,并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的,而不是单单用个检测器或是泵的。
  
  然后在这个基础上,我们再去比较这些主要指标。
  
  1、噪音
  
  是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度,噪音越大,检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好,否则噪音过大将会导致基线不稳,甚至影响分析结果。
  
  2、zui小检测浓度(zui小检测限)
  
  是反映仪器灵敏度的重要参数。CL=2×Nd×C/H(CL :zui小检测浓度 Nd:噪音 C:样品浓度zui小检测浓度 H:样品峰高)由上式可见,zui小检测浓度是和噪音成正比的,噪音越大,zui小检测浓度就越大,灵敏度就越低。某些厂家回避了这个指标,说明他们不愿在zui小检测浓度的基础上去比较噪音。
  
  3、漂移
  
  是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离,通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定,从而在一定程度上提高了分析效率。
  
  4、定性定量重复性
  
  主要是考核仪器稳定性的指标,这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分的,这就要求多次进样保留时间及含量的一致性,这样做出来的结果才能使人信服。
  
  有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。对的,但是就前面所说条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。例如:泵的脉动会直接影响噪音指标,泵的流量准确度、度指标,以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标。例如:某些公司在公布的指标中,噪音和漂移指标写的条件是空池或有的干脆不写。这个指标只考核了UV检测器光学和电气的特性,与实际情况相差甚远,并没有考验泵的压力脉动,液流回路的阻尼和UV检测器流通池的性能。所以我们认为从以上的主要指标中可以反应出仪器的一些真实水平。
  
  二、操作方便:
  
  操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。操作越简单,有利于提高分析效率,也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。上海伍丰科学仪器有限公司的工作站软件实现了真正的智能化操作。它摒弃了以往工作站软件只能起到数据处理的理念,在国内推出了集控制与后处理于一身的软件,在操作使用上给用户带来了极大的方便。
  
  三、系统的,整体开发
  
  这里指的是仪器的整体开发,是一个完整的系统。目前市场上有这个现象,说我的泵是进口的,或者是检测器怎么好,用了什么很多的进口件组装等等。其实这是个误区。液相色谱是个复杂的系统,不是整体开发的,各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配,整体水平不会高到哪里去,而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。
  
  整体开发的主要优点有:各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力。
  
  国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的,所以能够保证仪器的整体水平。
  
  四、稳定可靠,故障率低
  
  1、色谱柱的使用说明:
  
  (1)色谱柱使用前注意事项:
  
  色谱柱的储存液无特殊说明,均为评价报告所示的流动相。在使用前,一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中,如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,堵塞色谱柱。
  
  (2)流动相:
  
  流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯,配流动相的水是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好,尤其是含盐的流动相。另外,装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。 以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0,BDS C18适合于碱性化合物,PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时,每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗,并完全置换掉原来所使用的流动相。
  
  (3)样品:
  
  样品也要尽可能清洁,可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE)对样品进行预处理;若样品不便处理,要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时,所有的溶剂和样品应严格脱水。
  
  2、色谱柱的保存
  
  (1)反相色谱柱每天实验后的保养:
  
  使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。
  
  (2)长期保存色谱柱:
  
  如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中,离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度是室温。
  
  3、色谱柱的再生
  
  因为色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说可能是柱效下降。
  
  (1)反相柱的再生:依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90 (V/V),乙腈,异丙醇作为流动相冲洗色谱柱,完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
  
  (2)正相柱的再生:依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱,然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。
  
  4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法
  
  色谱柱在使用中zui常见的问题就是柱压升高,如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加,属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外),可能的原因有如下几点:
  
  (1)色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染;
  
  (2)色谱柱头的填料被样品污染;
  
  (3)色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂,形成结晶析出; (4)流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。
  
  解决办法如下:
  
  (1)如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染,可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力,或者卸下色谱柱头,将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟,后再用纯水超声10分钟,重新装入色谱柱。
  
  (2)如确定色谱柱头的填料被污染,将柱头螺丝卸下,挖出柱内前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔细修复后,重新安装上柱头螺丝。
  
  (3)如确定定是盐结晶,用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解,再换高浓度甲醇。
  
  (4)如果因PH值使用不当,很难恢复。


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