怎么使用酶标仪 酶标仪如何操作

    一、测定波长目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L0时，最大吸收波长移至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min.因此，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定常用的。各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6~8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大一般酶标仪的测定波长在400~750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。。除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定，故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个340nm波长滤光片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为340-750nm或800nm。酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，可以使用双波长，且不必设空白孔。

    二、测定的吸光度范围通常，酶标仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司DragonWellscanMK-2的吸光度测定范围为0-3.5，而MultiskanAscent的吸光度测定范围(Abs)达0-4.0，在0-4.0范围，线性误差不超过±2.0%，在0.3-3.0吸光度范围内，测定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0Abs范围内，测定精密度CV小于士0.2%。因此，对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，主要要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何。

    三、光学系统酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道(通常为8或12通道，亦有单通道)检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。光学系统好的话，则上述指标也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可避免因通道不同所致的差异。

适用：

利用酶联免疫吸附测定法用于食品及饲料中三聚氰胺的定量测定。

检测原理：

酶联免疫吸附测定法定量测定三聚氰胺残留。利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。先将三聚氰胺酶标记物，样品萃取物及标准加入到已经包被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。在30分钟的孵育过程中，样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，孵育30分钟后洗掉小孔中所有没有结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。再用去离子水清洗结束后，每孔中加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。孵育30分钟后停止此反应，根据各孔颜色深浅进行数据读取。依据标准的颜色得出样品中三聚氰胺的的浓度值。

设备及材料：

1、具有450nm的酶标分析仪

2、8头或12头洗板机(选配)

3、三聚氰胺检测试剂盒

4、可吸取50ul的移液器及吸头及.吸水纸

5、蒸馏水或去离子水

6、 20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸馏水定容至1000ml.

7、清洗液：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸馏水定容至1000ml.+0.5ml 土温20样品

饲料前处理：(稀释倍数：20)

1、称1g饲料样品，加入4ml甲醇；

2、震荡1min，加入0.1g氯化钠；

3、4000转离心5min；

4、取上清液0.2ml加入到0.8ml 20mMPBS中，混匀。

5、取150ul测定。

检测：

1、先将三聚氰胺酶标记物50ul，样品150ul及标准150ul加入到已经包被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。

2、在30分钟的孵育过程中，样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体；

3、孵育30分钟后用清洗液洗掉小孔中所有没有结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。清洗四次后，放在桌上用吸水纸吸掉微孔板里多余的水份；

4、清洗结束后，每孔中加入100ul清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。

5、孵育30分钟后加入100ul 停止液STOP停止此反应，根据各孔颜色深浅进行数据读取。依据标准的颜色得出样品中三聚氰胺的的浓度值

结果分析：

1、半定量的结果是由样品的吸光率与标准的吸光率的简单对比而来判定：样品的颜色比标准的颜色浅，则三聚氰胺的浓度比标准样的浓度高，样品的颜色比标准的颜色深则三聚氰胺的浓度比标准样的浓度低。

2、定量分析需要绘制以标准样的吸光率为X轴,以标准样的浓度的半对数为Y轴的曲线图。依据标准样。吸光率的点画成一直线,如此样品的光吸收率可在线上找到,与此相对应的Y轴则为样品的浓度,样品光吸收率。范围应比标准样的最底范围高,比最高范围低, 即可说明此样品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。

特点：

本产品为酶联免疫吸附测定法(ELISA)法，灵敏度高、检测成本低，可适用于生产及检验单位大批量快速筛查。