色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10μm等,柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析,只要500即可;对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子,因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
在选择色谱柱规格时应考虑下列因素:
①色谱柱内径:样品的上样要与色谱柱的交叉截面面积相对称,要选择色谱柱的内径要适合于样品的上样量。
②填料的粒径:越小的粒径具有越高的柱效,但是价格更高,并且带来更高的柱压,要求设备的硬件具备更高的压力耐受性。在被测组分的色谱峰与其它色谱峰非常靠近时,就需要更高的柱效,此时较小粒径的色谱填料就显得非常有用。相反,越大的粒径则柱效越低,但价格也相对较低,同时对设备的要求也不高。
③色谱柱长度:越长的色谱柱具有越高的柱效和更高的样品承载量,但是柱压将会更高,同时分离时间可能会更长。
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1.色谱柱断裂
熔融石英色谱柱的聚酰亚胺涂层如有少许破裂它就会断裂。聚酰亚胺涂层可保护易碎的熔融石英管线。柱温箱持续的加热或冷却、柱温箱风扇的震动以及把色谱柱绕在圆形柱架上均会对管线造成压力。zui后在薄弱处发生断裂。通过轻划或磨损聚酰亚胺涂层会造成出现薄弱处。通常锋利的尖或边划管线时会造成划痕。色谱柱挂钩和标签、GC 柱温箱的金属边、色谱柱切割器以及实验室实验台上的各种物品都带有锋利的尖或边。色谱柱自身断裂的情况很少。色谱柱制造业试图找出所有有缺陷的管线并避免在已制好的色谱柱中使用这些管线。
直径较大的色谱柱更容易断裂。也就是说在处理0.45-0.53 mm 内径的管线时要比处理0.18-0.32 mm 内径的管线更加谨慎以防断裂。已断裂的色谱柱并非不能用。如果已断裂的色谱柱保持在高温下连续运行或运行多个温度程序,则将十分容易损坏。已断裂色谱柱的后半段暴露在高温的氧中会迅速损坏固定相。而色谱柱的前半段因有载气通过仍会保持完好。如果已断裂的色谱柱未经加热而是仅在高温或含氧的环境下暴露很短时间,则后半段将不会受到任何严重损坏。可以通过安装接头来接上已断裂的色谱柱。任何合适的接头都可重新连接色谱柱。一支色谱柱上不能装入超过2-3 个接头。多个接头会造成死体积(拖尾峰)问题。
2.热损坏
超出色谱柱的温度上限会造成固定相和管表面的加速损坏。这样会造成色谱柱的过分流失,活性组分形成拖尾,以及/或降低柱效(分离度)。幸好热损坏是一个很慢的过程,因此,在色谱柱严重损坏之前还有一段很长的时间可在高于温度极限的条件下使用。当有氧存在时会大大加速热损坏。对有泄漏或载气中氧含量较高的色谱柱进行过度加热可快速并*地损坏该柱。将GC 的柱温箱zui高温度设定为色谱柱温度极限或稍高于该温度极限是防止热损坏的zui佳方法。这样可避免色谱柱意外的过热。即使色谱柱受到热损坏,仍然可使用。把色谱柱从检测器上卸下来。在色谱柱的恒温温度极限下,将其加热8-16 小时。把色谱柱接到检测器的一端截去10-15 cm。按正常情况安装色谱柱并进行老化。色谱柱将不能恢复到原来的性能,但仍可使用。在热损坏之后色谱柱的寿命会缩短。
3.氧损坏
氧是许多毛细管GC 柱的大敌。在室温或近于室温的温度下,不会损坏色谱柱,但随柱温的升高色谱柱将被严重损坏。通常,对于极性固定相,在较低的温度和氧浓度条件下,就可发生严重损坏。长时间暴露在氧气中会出现氧损坏的问题。短时间暴露在氧中(如注射空气或快速取下隔垫螺母)不会有什么问题。
载气流路(例如气路、接头、进样器)中的泄漏往往是暴露在氧中的源头。随着色谱柱的加热,会很快地损坏固定相。这样会造成色谱柱的过度流失,活性组分形成拖尾,以及/或降低柱效(分离度)。其征兆与热损坏相似。不幸的是发现氧损坏之时色谱柱已经受到严重的破坏,在不太严重的情况下,色谱柱仍可使用,但性能有所下降。在严重的情况下,色谱柱将完全不能使用。
让系统避免和氧接触和避免泄漏是不受到氧损坏zui有效的方法。良好的维护GC 系统包括定期检查气路和压力表的泄漏、定期更换隔垫、使用高质量的载气、安装和更换氧捕集阱、在气体钢瓶完全用完之前就更换。
4.化学损坏
有相当少的化合物能损坏固定相。不挥发性化合物(高分子量或高沸点)进入色谱柱通常会降低色谱柱的性能,但不会损坏固定相。使用溶剂冲洗色谱柱通常可消除残留并恢复色谱柱的性能。要避免进入色谱柱的主要化合物是无机酸和碱。大多数这些酸和碱不易挥发,会积聚在色谱柱前端。如果不清除它们,将会损坏固定相。这样会造成色谱柱的过分流失,活性组分形成拖尾,以及/或降低柱效(分离度)。其征兆和热损坏及氧损坏相似。盐酸和氢氧化铵是这一类化合物中危害zui小的。这两种物质易溶于样品中的水。如果水不停留或几乎不停留在色谱柱中,HCl 和NH4OH 在色谱柱中停留的时间就会很短。这就消除或降低了这些化合物所造成损坏的可能性。因此,如果样品中含有HCl 或NH4OH,使用不保留水的环境或色谱柱,即可相对减小这些化合物对色谱柱的危害。只有全氟*酸是可以损坏固定相的有机化合物。这些示例包括三fu 乙 酸、五fu 丙 酸和七 fu 丁 酸。它们需在高浓度(例如1% 或更高)时才有破坏作用。大多数问题发生在不分流进样或大口径直接进样的过程中,其中大量的样品会沉积在色谱柱前端。由于化学损坏多发于色谱柱的前端,因此把色谱柱的前端修整或切割掉1/2-1 米通常可以消除所有色谱方面的故障。在更为严重的情况下,可能需要切割掉5 米或更长的一段。使用保护柱或保留间隙柱会将对色谱柱的损坏降至zui小,但是,需要经常修整保护柱。酸或碱常常会破坏熔融石英管线的脱活表面,从而引起活性化合物的峰形变坏。
5.色谱柱被污染
在毛细管GC 中色谱柱被污染是很普遍的问题。不幸的是它和各种常见的问题相似,因此常常被错误地判断为其他故障。通常,受污染的色谱柱虽然没有损坏,但却不能再使用。有两种基本的污染物:不挥发性污染物和半挥发性污染物。不挥发性污染物或残留物不会洗脱出来,而会积聚在色谱柱内。这样色谱柱即成为涂渍了残留物的色谱柱,因而影响了溶质在溶入固定相和洗出固定相的正确分配。而且残留物还会与活性溶质相互作用,从而引起峰的吸附问题(例如拖尾峰或峰面积减少)。活性溶质是指含有羟基(-OH) 或氨基(-NH) 以及某些硫醇基(-SH) 和醛的物质。积聚在色谱柱内的半挥发性污染物或残留物,zui终会被洗脱出去。但需要几个小时甚至几天才完全从色谱柱中洗脱。与不挥发性残留物一样,它们也会引起峰形和峰面积出现问题,此外,通常还会引起很多基线问题(不稳定、偏离、漂移、鬼峰等)。污染物的来源有许多,其中进样是zui主要的来源。萃取自基质复杂的样品。如生理体液和组织、土壤、废水、地下水和类似的基质均含有大量的半挥发性和不挥发性物质。即使采用了仔细并彻底的萃取方法,样品中还是会含有少许这些物质。进行几次直到几百次进样后,积聚的残留会引发问题。进样技术如柱上进样、不分流进样、和大口径柱直接进样均会将大量样品进到色谱柱中,因此采用这些进样方法常常会造成色谱柱的污染。
有时,污染物来源于气路和捕集阱、密封垫圈和隔垫颗粒中的材料,或任何与样品接触的物质(样品瓶、溶剂、注射器、移液管等)。如果突然出现污染问题,但在前几个月或前几年类似的样品均未导致出现任何问题,则说明问题来自于这些种类的污染物。
zui大限度地减少半挥发性和不挥发性样品残留是减少污染问题的zui佳方法。然而是否存在污染物以及存在哪些污染物通常是不为人知的。严格和彻底的净化样品是防止出现污染问题的zui佳方法。使用保护柱或保留间隙柱通常可以减轻色谱柱污染所引发问题的严重程度或推迟这些问题的出现。如果色谱柱已被污染,则zui佳方法是使用溶剂冲洗色谱柱以去除污染物。建议不要使用长时间加热(通常称为烘烤色谱柱)的方法来处理受到污染的色谱柱。因为烘烤色谱柱可能会把某些污染物残留变成不能溶解的物质而无法通过溶剂清洗将它们从色谱柱中去除。如果出现这种情况,通常就无法再恢复色谱柱了。有时可将色谱柱切割为两段,后半段可能仍可使用。在色谱柱的恒温极限下烘烤色谱柱时,时间应不超过1-2 个小时。
柱效(columnefficiency),是指色谱柱保留某一化合物而不使其扩散的能力。柱效能是一支色谱柱得到窄谱带和改善分离的相对能力。
柱效,从名字上理解是色谱柱的分离效果。色谱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低,色谱柱的柱效越好,类似于每个塔板的分离效率相同,有效塔板数越多,最终得到的物质越纯。
柱效率是指溶质通过色谱柱之后其区域宽度增加了多少,它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关,这是所谓色谱的动力学过程。
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从塔板概念评价柱效
根据塔板理论,可以计算一根色谱柱所达到的理论塔板数,或表达为每米理论塔板数n/m。把相当于一个理论塔板的柱子长度称作理论塔板高度H,通常采用有效塔板数N和有效塔板高度L来表达柱效,W为峰宽,W1/2为半峰宽:
N=16(Tr/W)^2
=5.54(Tr/W(1/2))^2
=L/H
显然,N值越大,或H值越小,柱效越高。分散效果主要取决于所选择的固定相。
从柱的算公式上我们可以看出柱效主要跟理论塔板数和柱长有关系。我们来解释一下理论塔板数。
理论塔板数(theoreticalplatenumber),N是色谱柱效的参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为:
理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2(2是平方)
柱效率用理论塔板数定量地表示:N=16*(t/w)2。其中,t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间,w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候,不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。因此理论塔板数大的色谱柱效率高。当然,N的大小和柱子长度有密切关系:理论塔板高度H=柱长/N,用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率,H越小,则色谱柱效率越高。。。N为常量时,W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上,如果各组份含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更容易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)
离子色谱柱的柱效一般由硫酸根的理论塔板数来计,理论塔板数可以由色谱仪工作站直接读出,一般离子色谱柱的柱效大于1000个塔板数.
柱效下降会有什么现象?
1.看峰分离度,分离度直接关系测试结果准确性,可以判断柱效是否下降,柱效下降分离度一般会变差。
2.测定色谱柱的塔板数来判断
3.通过压力变化和出峰时间来判断,一般柱效下降时伴随着柱压的升高和降低,此时出峰的时间也会和之前有很大差异。
4.还可以根据新的柱子的保留时间判断,看重复性,平行性如何.
5.通过谱图峰型的变化,是否有严重前伸和拖尾现象,如果峰型很差了,柱效已经下降了
柱效下降后如何来提高柱效。
离子交换柱长时间在缓冲溶液中使用和进样,将导致色谱柱离子交换能力下降,.用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生,反之,用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生.另外,还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗.但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的.如果柱子装反了,可以调回来,但可能会造成柱内担体塌陷.在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。