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高效液相色谱紫外检测器需要信噪比指标 液相色谱如何操作

时间：2020-07-03    来源：仪多多仪器网    作者：仪多多商城     
【导读】紫外检测器是高效液相色谱中常用的检测器，目前市场上生产厂家及型号很多，厂家通常采用检测器的噪音，基线漂移等技术参数作为产品的灵敏度性能评价指标。考虑到样品的紫外吸收响应值主要与样品有关，与仪器的

紫外检测器是高效液相色谱中常用的检测器，目前市场上生产厂家及型号很多，厂家通常采用检测器的噪音，基线漂移等技术参数作为产品的灵敏度性能评价指标。考虑到样品的紫外吸收响应值主要与样品有关，与仪器的关系不大，一般认为这可以基本反映仪器在灵敏度方面的性能。

本文在实验的基础上证明对同一样品各检测器的响应值实际上也存在不同程序的差异，说明仅使用噪音和基线漂移的指标不能准确显示仪器在灵敏度方面的性能差异，因此，提出用信噪比来评价仪器的灵敏度性能。
2 灵敏度评价指标设置的目的和依据
高效液相色谱及其紫外检测器主要用于化学样品的分析测试。其评价指标必然与其用途相关联。一个分析方法对检测器的要求主要在灵敏度、选择性、精确度和准确性方面。在色谱分析中灵敏度是非常重要的指标。对于灵敏度，在分析测试方法研究中主要使用信噪比、最低检测限，或最低定量限来评价。其中信噪比是评价的核心，因为最低检测限和最低定量限通常用信噪比在2~3和10的量来定义。
但目前厂家通常采用检测器的噪音，基线漂移等技术参数作为产品的灵敏度性能评价指标。这实际上是基于样品的紫外吸收响应值主要与样品有关，与仪器关系不大的假设。根据朗伯比尔定律，对于同样长度的检测池，同样浓度的样品溶液应该具有相同的吸光度。这样，对同样浓度的样品溶液，检测器的响应值应该是相同的，所以上述噪音，基线漂移的参数应该可以用来评价检测器的灵敏度性能。
但是，实验中发现，同一样品溶液在不同检测器中响应实际上存在明显差异，表1显示对于同一种样品溶液，不同厂家和型号检测器的响应值可能相差3倍以上。这时，由于色谱分析主要使用相对比较的间接测定方法，其使用实际上并没有受到多少影响。难以简单认定仪器存在问题。但因为信噪比发生了变化，上述噪音、基线漂移的参数就不能用来评价检测器的灵敏度性能了。

此时，直接使用信噪比来评价检测器的灵敏度性能才是可靠和准确的方法。
3 信噪比指标评价方法
评价信噪比需要测定响应值，需要选定样品，推荐萘和L-苯丙氨酸等在254nm附近有吸收的样品，前者常用于色谱柱性能评价;后者无毒，且对仪器可能存在的偏振现象敏感。当然，即使使用不同的评价样品，只要固定浓度和溶剂，也可以用分光光度计来校正和比较。
根据现有信噪比测定方法，在选定特定浓度的样品后，先在选定波长平衡检测器(此时检测器中的溶液为溶解评价样品的溶剂)，待基线稳定后，将配制好的样品溶液直接灌注到仪器的流路并充满其中，注意不要灌入气泡，信号稳定后再用溶剂将样品溶液冲出来。测定基线上下波动的幅度为噪音值(N)，测定基线中值与样品信号中值的差为信号值(S)。则信噪比为两者的比值(SN)。

4 结论
使用信噪比(SN)指标评价检测器，可以更准确全面地评价各种检测器的灵敏度性能。评价时可以参考现有的信噪比测定方法，建议用254nm作为检测波长，选择简单易得的样品，浓度值的选定应使信噪比SN的值在10以内，以方便测量。配制特定浓度的评价溶液后，以灌注法测定此时相对溶剂的响应值S，测定和计算出信噪比SN的值，作为该检测器对特定评价样品溶液的信噪比评价指标的值。

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　　色谱法是一种常见的分离技术，其原理是利用欲分离组分在两相间具备不同的分配系数，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中的不同物质以不同速度沿固定相移动，终达到分离的效果。
 
　　按两相的物理状态，可以分为气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)，在现代样品分析中，气相色谱和液相色谱都是普遍采用的分析方法，但两者也存在许多不同之处，具备不同的特性，这些特性也决定了它们不同的应用范围。
 
　　一、GC与LC的主要差异
 
　　1. 流动相区别
 
　　GC：流动相为惰性气体，流动相与组分无亲合作用力，只与固定相有相互作用。
 
　　LC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用。
 
　　2. 色谱柱长度区别
 
　　GC：色谱柱长度在几米到几十米不等。气相色谱由于载气的相对分析量较低，分子间隙大，故粘度低，流动性好，组分在气相中流动速度快，因此可以增加柱长，以提高柱效。
 
　　LC：色谱柱通常在几十到几百毫米。
 
　　3. 分析样品选择性
 
　　GC：相对分子质量较小(一般小于1000)，低沸点(一般小于500℃)，易挥发，热稳定性。
 
　　LC：更适用于分析高沸点，难挥发,热稳定性差，分子质量较大(1000 - -2000)的液体化合物。
 
　　据统计，气相色谱能分析的有机物只占全部有机物的15%-20%，其可分析样品的范围小于液相色谱，但随着近几年技术的更新，如顶空进样和裂解进样等，进一步扩大了气相色谱的分析范围。
 
　　4. 检测器差异
 
　　GC：氢火焰离子化检测器(FID)，热导检测器(TCD)，电子捕获检测器(ECD)，火焰光度检测器(FPD)，氮磷检测器(NPD)。
 
　　LC：紫外检测器，荧光检测器，示差折光检测器。
 
　　5. 其他方面
 
　　GC：需要将样品在气化室气化，需要较高的检测温度，采用尖头进样针。
 
　　LC：不必对样品气化，常温即可检测，采用平头进样针。
 
YL6500GC气相色谱仪
 
　　二、GC与LC的主要相同点
 
　　基本的原理相同，都是吸附-脱附平衡，利用组分在固定相和流动相中的分配系数不同达到分离的目的。也就是说，两者都是利用物质在流动相和固定相中的分配系数的差别，从而在两相间反复多次(1000-1000000次，甚至更多)的分配，使原来分配系数差别很小的各组分分离开来。在本质上，都是利用“相似相溶”原理，利用色谱柱进行分离。
 
YL9100液相色谱仪
 
　　三、小结
 
　　气相色谱具有分离效率高，分离速度快，样品用量少，选择性好，检测灵敏度高等特点，在食品、环境、化工等领域都具有广泛的用途；液相色谱分析范围广，对于难分离混合物的分析具有很好的准确性，样品回收容易，因此液相色谱不仅仅作为一种分析方法，也作为一种分离手段应用在食品医药等行业。
 
　　随着应用领域的不断深入，单一的色谱分析技术已经不能完全满足现有的市场需求，所以诞生了气相色谱串联质谱(GCMS)、液相色谱串联质谱(LCMS)等新的分析技术，用于更好地分离分析样品。
 
　　------ 责任编辑：瑞利祥合--分析仪器采购顾问
 
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　　聚四氟乙烯膜(一般用于有机相)几乎可以和所有的溶剂、酸和碱相容。
 
　　尼龙66膜(一般用于有机相)可以和大多数溶剂、有机物和水相容，建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF。
 
　　纤维素硝酸酯(一般用于水相)主要用于过滤器,可以和多数水性和非水性溶剂相溶,但不是所有的水性和非水性溶剂。
 
　　再生纤维素膜一般用于HPLC生物样品和有机溶剂的制备和过滤,是通用型HPLC过滤器,具有广泛的溶剂相溶性,与蛋白质键合作用低,非常低的可萃取性.在样品溶液中有颗粒存在会造成故障时要用膜进行过滤。
 
　　“漏”分两种：漏液和漏气。
 
　　漏液：
 
　　液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生漏液，那就是故障所在。
 
漏液的原因分两种：
 
　　接触硬件不当：在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选项用PEEK接头是一较好是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松；另一种不当就是致命的错误：滑丝，这往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。
 
　　使用仪器不当：只要互相有10%比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲液盐溶液(不论甲醇含量有多少)作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。
 
　　漏气：
 
　　漏液是从内部向外漏，而漏气则是外部了的气体进入液相色谱仪的流路内部形成气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。
 
　　2.1过滤头：油液时，在流路管中有不规则但持续的小气泡产生，这时考虑的是流动相有没有脱气(需要特别提醒即使是有了真空脱气机也是要先超声脱气的，起码可以减少脱气机的工作压力并提高工作效率)，如果已经脱砂压力了气，则要注意过滤头的污染也会造成这种现象。处理方法比较简单，拧下过滤头在稀硝酸中浸泡，超声半小时，洗净后装回去即可。
 
　　2.2透明流路管：指的是在过滤头和输送泵之间的那一段管路。这一个部分往往不是有点气泡，而经常是整个管中全是空气而操作人员却浑然不知，以致输送泵工作了半天才发现流动相瓶里的液体一点也没少。这也是我们常说的液相色谱仪至少一周要开机一次的原因(我们做液相一定要有“微渗”的概论)。如果长时间不用，这一段管路的液体会彻底干掉，而充满空气的管路和充满液体的管路不仔细看是分辨不出来的。这种情况对于输送泵很危险，因为泵从设计来说是输送液体而不是输送气体，内部的液体对于活塞来说起到了机油的作用，如果活塞杆还残存了一些缓冲盐，则极易拉伤，造成不可逆转的影响。对于这种情况，要突出“预防为主”如：液相色谱使用人员要相对固定和稳定，工作中合理搭配资源，每台机一周至少一次实验，如长期不用起码每周要冲流动相2小时。养成良好的工作习惯很重要。
 
　　如果流路管中真漏气了怎么办？
 
　　我的建议是用外力使管路中充满液体。
 
　　具体如下：
 
　　1、找到流路管进入输送泵的接头。
 
　　2、拧下来。
 
　　3、用一干净洗耳球的尖端对准管路的平整切口。
 
　　4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。
 
　　5、快速把接头拧回输送泵上(这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象)。
 
　　6、开机，打开排液阀门，启动输送泵。
 
　　7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。
 
　　2.3输送泵和柱子：这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。
 
　　2.4检测器：应该说整个流路中只要有一个气泡都会在检测器上得到强烈的信号反映，检测器内部的气泡一般都能被冲走，但也有很难冲掉的残留气泡的情况。如果检测器内有残留气泡，会有特别明显的表现形式，就是在走基线时会时不时间隔出现直上直下信号很大的信号峰。这时先看普通流量能否冲走，如果冲不走，那唯①的办法就是拆柱，把检测器直接连接到输送泵的出口，加大几部流量冲洗，则肯定能冲走气泡。
 
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