高效液相色谱法(HPLC:High Performance Liquid Chromatography )是70年代迅速发展起来的一种分离分析技术,是目前各种色谱模式中应用广泛的一个领域,据估计,世界上几百万种化合物中除20%宜用其相色谱分离分析外,其余80%的化合物,包括大分子化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC进行分离分析。
自80年代以来,HPLC以成为国际分析化学界发展较快的一个分支。随着高效液相色谱设备的不断更新换代,功能和分析手段的逐渐增加,高效液相色谱仪在生物化学、生物工程、医药研究、食品分析等各个领域中被广泛应用;是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。高效液相具有简便、快速、分辨率高、检测限低、重复性好,定量精度高等特点的同时,还必将会在提高检测质量和速度上有更大的发展前景。
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日常维护和保养
贮液器:清洁是保持流动相贮液器正常使用的关键,要尽可能使用HPLC级的溶剂和试剂含有缓冲盐和非HPLC级的流动相一定要通过0.5μm的过滤器以除去其中的微粒物质。改变流动相时应防止交叉污染,陈旧的流动相和用久了的试剂瓶应定期废弃,防止生长微生物和组分改变。贮器内壁定期清洗,里面的附件要经常更换。
泵:泵的密封圈是最易磨损的部件,密封垫圈的损坏可引起系统的许多故障。有人建议3个月换一次垫圈。但也不能一概而论,要看垫圈的材料质量,使用压力大小、保养以及缓冲液的情况而定。采取下列措施可以延长垫圈的寿命:
1 每天要把泵中的缓冲液体洗干净,防止盐沉积,泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中;
2 用HPLC级试剂;
3 用烧结不锈钢沉子。要注意防止因泵阻塞造成压力过高而损坏柱塞杆或烧坏电机。
进样器:停机后要用溶剂冲洗干净进样器内残留的样品和缓冲盐,防止无机盐沉积和样品微粒造成阀转子面磨损或阻塞,严禁用气相色谱那样的尖针头进样。
色谱柱:防止柱性能下降有以下几方面的措施:
1 溶剂的化学腐蚀不能太强;
2 避免微粒在柱头沉降;
3 泵上要装压力限制器,防止压力过高冲击大;
4 流动相PH>7时用大粒度同种填料作预柱;
5 柱头加烧结片不锈钢滤片,需要时加保护柱;
检测器:要保持检测器清洁,每天用后连同色谱柱柱一起冲洗。提倡不定期用强溶剂反向冲洗检测池(拆开柱)。用脱过气的流动相,防止空气泡卡在池内。检测器灯有一定的寿命,不用时不要打开灯。
操作极限:每台泵都有压力上限,系统达到预定值时会自动停泵,这样能保护柱和其他硬件。上限压力设在20MPa以下,泵垫圈和进样阀耐用,但压力上限设定过低会延长分析时间。根据检验设定压力上限在15~20MPa为宜。新柱的压力比较低,随着使用时间加长而压力上升,所以设定的压力上限也应变化。在梯度洗脱中应考虑因流动相的变化而引起的压力变化,避免上限压力过低造成中途停泵。带有微机的系统还需设定压力下限,一般在0.5~1MPa,在贮器中流动相被抽干或严重渗漏时会自动停泵。有时下限压力设在0也会自动停泵。