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可见分光光度计的使用过程 光度计是如何工作的

时间:2020-07-05    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】一、开机开机前将样品室内的干燥剂取出,确认电源是否连接。打开仪器电源开关,等待仪器自检通过,自检过程中禁止打开样品室。二、使用仪器自检结束后(7个自检项



    一、开机
    开机前将样品室内的干燥剂取出,确认电源是否连接。打开仪器电源开关,等待仪器自检通过,自检过程中禁止打开样品室。
    二、使用
    仪器自检结束后(7个自检项目均出现OK字样),按[MAINMENU]键(主菜单),屏幕显示如下5个功能项:
    1、Phtometry(定量运算);
    2、WavelengthScan(波长扫描模式);
    3、TimeScan(时间曲线扫描);
    4、System(系统校正);5、Datadisplay(光度直接测量模式)。按相应选项前的数字键,即可进入该选项的下一级子菜单。
    1、Phtometry(定量运算)
    1)按[MAINMENU]键,再按数字[1]键进入Phtometry子菜单下,选中对应的数字来选择所需的测定方式:
    ①%T/ABS(透过率/吸光度测定模式);
    ②Ratio(比例测定模式);
    ③Concentration(浓度测定模式或标准曲线模式);
    2)按数字[1]键进入%T/ABS(透过率/吸光度测定)子菜单,选中对应的数字键来设定测定条件:①NUMWL(设定测试波长的数目,较多可设定6个不同波长);
    ②WLSetting(设定测试波长具体数值)③DataMode(选择测定吸光度或透光率),设定完毕后点击[Enter]键确定,所有项目设定完毕后按数字[0]键确定,等待仪器调整至准备状态,此时屏幕上出现AUTOZERO,将盛有空白溶液的比色皿放入样品室中,按[Start/Stop]键进行零点的自动调整,自动调零完成后,将样品置于光路中,再按[Start/Stop]键进行测量,仪器的显示屏自动给出对应波长的数值。
    3)按数字[3]键进入③Concentration(浓度测定模式或标准曲线模式),选中对应的数字来设定条件(波长数目,波长数值,标准溶液数目及浓度),设定完毕后点击[Enter]键确定,所有项目设定完毕后按数字[0]键确定,等待仪器调整至准备状态,此时屏幕上出现AUTOZERO,将盛有空白溶液的比色皿放入样品室中,按[Start/Stop]键进行零点的自动调整,自动调零完成后,将标准溶液置于光路中,按照浓度从低到高顺序依次按[Start/Stop]键进行测量,测量完毕后仪器将自动给出标准曲线,标准曲线下方有三项供选择:①Process(更改标准曲线的坐标和观察浓度回归曲线的数据);②Measure(直接进入样品的测量);③Print(打印浓度回归曲线谱图和数据),选中对应的数字就可执行相应的功能。
    4)如果希望返回上一级菜单,按[CLEARRETURN]键返回,返回主菜单直接按[MAINMENU]键。
    2、WavelengthScan(波长扫描模式)
    1)参数修改:按[MAINMENU]键,再按数字[2]键进入②WavelengthScan(波长扫描模式)子菜单下,选中对应的数字来选择所需修改的内容,修改扫描的起始波长,测量模式,图谱坐标的上下限,扫描速度等等。修改完毕按数字[0]键确定。
    2)波长扫描:分别将两个比色皿装上空白溶液和样品溶液,放入比色槽中,按[Start/Stop]键进行谱图扫描(如想终止扫描再次按按[Start/Stop]键),待仪器自动进行基线校正,提示拉入样品自动测试,测试完毕后有扫描图谱出现,下方有相应的数据处理选项①Process②Baseline③Print;
    3)数据处理:按数字[1]键进入①Process(数据处理),可以读峰谷值,修改坐标,显示所有数据,求一阶倒数等等功能。
    3、TimeScan(时间曲线扫描)
    同上(二)操作。
    4、System(系统校正)
    一般不做。
    5、Datadisplay(光度直接测量模式)
    同上(二)操作。
    三、关机
    将比色皿中的溶液倒尽,然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净;关电源将干燥剂放入样品室内,盖上防尘罩,做好使用登记,得到管理人员认可方可离开。





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分光光度计的工作原理

  事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值可以在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

  除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。

  蛋白质的直接定量(UV法)

  这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320nm的“背景”信息,设定此功能“开”。与测试核酸类似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,较佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时,发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上,只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度,乘以一定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。

  比色法蛋白质定量

  蛋白质通常是多种蛋白质的混合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。

标签: 分光光度计
分光光度计 分光光度计的工作原理_分光光度计



    原子吸收分光光度计将在上述领域的科研、生产工作中起到人们意想不到的巨大作用。但是,要用好原子吸收分光 光度计并不是一件容易的事。


    主要是因为影响原子吸收分光光度计分析误差的因素太多。本文将根据笔者的使用实践,并结合有关文献,从zui常用的火焰法和石墨炉法两个方面来讨论影响原子吸收分光光度计分析误差的主要因素和如何用好原子吸收分光光度计等问题。

 


    火焰法


    影响火焰法原子吸收分光光度计分析误差的主要因素,归纳起来大约有36个以上:


    1、火焰高度;2、吸收线(灵敏线和次灵敏线);3、火焰温度;4、火焰稳定性;5、燃气和助燃气的质量;6、助燃比;7、雾化率;8、气体流量大小;9、气体流量稳定性;10、试样的吸喷量;11、原子化效率;12、扣背景方式;13、扣背景水平;14、光源强度;15、光源的热稳定性;16、光源的电源稳定性;17、灯电流大小;


    18、边缘能量;19、波长范围;20、波长准确度;21、波长重复性;22、杂散光;23、透镜的色差;24、透镜的透过率;25、光栅的闪耀波长;26、光栅的反射率;27、单色器中反射镜的反射率;28、光谱带宽(sbw);29、光电倍增管(pmt);30、pmt高压;31、放大器的噪声;32、放大器的漂移;33、数据处理方法(计算方法);34、环境(电、磁场)干扰;35、环境温度;36、整机供电电源等。


    石墨炉法


    影响石墨炉法原子吸收分光光度计分析误差的主要因素,归纳起来大约有49个以上:


    1、光源强度;2、吸收线(灵敏线和次灵敏线);3、光源灯泡稳定性(热稳定性);4、光源电流稳定性(纹波、漂移等);5、石墨管结构(平台、普通);6、石墨管加热方式(纵向、横向);7、石墨管温度稳定性;8、原子化效率;9、扣背景方式(氘灯、自吸、塞曼);10、扣背景能力;11、升温速度;12、加温方式;13、干燥温度;14、干燥时间;15、灰化温度;16、灰化时间;17、原子化温度;18、原子化温度保持时间;


    19、清洗温度;20、清洗时间;21、边缘能量;22、波长范围;23、波长准确度;24、波长重复性;25、杂散光大小;26、透镜的色差;27、透镜的透过率;28、光栅的闪耀波长;29、光栅的反射率;30、单色器中反射镜的反射率;31、sbw;32、pmt(id;gan);33、pmt高压(i0;sd;sr);34、放大器增益;35、放大器漂移;36、电子学系统的噪声;


    37、数据处理(计算方法);38、进样技术(手动);39、环境中电、磁场干扰;40、环境温度;41、环境中振动源干扰;42、供电电源(电流;电压);43、保护气种类;44、保护气质量;45、保护气流速;46、内气和外气比例的选择;47、计算公式(非线性拟合方程);48、标准溶液是否标准(制备方法、浓度大小);49、空白溶液的选择(火焰时,空白溶液不能为0,否则不稳;测量rsd时,一般空白溶液为0.5%的硝酸)等。


    以上49个因素中,只要有一个不好,就不可能得到好的分析结果,就将严重影响分析测试结果的可靠性。这些因素都是研制者(或生产者)如何保证石墨炉原子吸收分光光度计质量、使用者如何选择和用好石墨炉原子吸收分光光度计时应高度重视的问题。







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