荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。荧光分光光度计具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。
荧光分光光度计工作原理：
由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在较为适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱（emissionspectrum），简称荧光光谱。
荧光分光光度计测试注意事项：
①样品应盛在四面透光的石英比色皿（荧光池）中，如果是挥发性样品应使用带塞的荧光池。
②在荧光分析时，为了得到稳定可靠的数据，一般需要开机预热氙灯大约30min。如果仪器光源采用的是闪烁氙灯，预热时间可以缩短到10min左右。对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长、低人射光强度及短时间光照。
③温度变化可引起荧光强度的改变。通常降低温度，有利于提高荧光量子产率，荧光强度增大。温度影响荧光强度的显著程度因样品而异，大部分荧光物质的荧光强度受温度影响不大，测试温度变化不超过±3℃，对测试结果几乎无影响。
④当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡会发生改变，而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。
⑤荧光物质分子与溶液中其它物质分子之间作用导致荧光强度降低，常见的荧光猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、02、硝基化物质、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象，因此，在较严格的荧光实验中必须除02。
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分光光度计，又称光谱仪(spectrometer)，是将成分复杂的光，分解为光谱线的科学仪器。测量范围一般包括波长范围为380~780 nm的可见光区和波长范围为200~380 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的380~780nm波长的光谱光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源。
光度定义
分光光度法是在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性或定量分析。常用的波长范围为:(1)200~380nm的紫外光区，(2)380~780nm的可见光区，(3)2.5~25μm(按波数计为4000cm<-1>~400cm<-1>)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。
仪器组成
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。
原理
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 为吸光度;
I。为入射的单色光强度;
I 为透射的单色光强度;
T 为物质的透射率;
k 为摩尔吸收系数;
L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长;
c 为物质的浓度;
物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。
分光光度计是利用物质对光的选择性吸收进行物质的定性或定量分析的仪器，在各行各业得到了广泛应用，主要用于物质纯度检查、定量分析、物质结构鉴别等。可测量结果总会出现可接受或不可接受的误差，误差来源于测量过程的各个方面，我认为主要来源于仪器本身性能和测量条件的选择两个方面。
一、仪器本身性能带来的误差
1.杂散光的影响
杂散光是指进人检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的其他波长组分，它是光谱测量中误差的主要来源。产生原因有:分光光度计的色散元件、反射镜、透镜及单色器内壁灰尘等。在分光光度计工作波段边缘波长处，由于单色器透光率、光源辐射强度、检测器灵敏度都较低，杂散光的影响更为显著。杂散光限制仪器的分析上限可引起严重的测量误差，实际工作中，在定量分析时，一般在吸收峰或其附近处测量样品吸光度，如果在分析波长处含有杂散光，这时样品的透光率较小，而杂散光大部分透过，使测量吸光度低于真实吸光度。
2.仪器噪声对测量的影响
仪器噪声也是仪器的一个重要指标，它表征仪器做稀溶液的能力。是叠加在待测量的分析信号中的不需要的信号，扫描100%T和0%T线，可观察到分光光度计的绝对噪声水平，如果仪器噪声较大，会掩盖较小的测量信号，一般用噪音的二倍来表示仪器的灵敏度。
3.波长和吸光度准确度
样品的每一个值都是在一定的波长下测得的，如果波长误差很大，测出的值肯定不准。吸光度准确度也是用户对仪器的直接要求，更应引起足够的重视。国家计量检定规程规定双光束紫外可见分光光度计透射比准确度为A级士0.6%,B级土1.0%。
二、测量条件的选择
1.吸光度范围的选择
试样在不同吸光度时，浓度的相对误差不同，一般选择A二0.2一0.8之间，浓度相对误差较小，可以通过改变吸收池厚度、检测波长或待测溶液浓度，使吸光度读数在适宜范围内。
2.狭缝宽度的选择
狭缝宽度不仅影响光谱的纯度，也影响吸光度值，在定量分析时，为了得到足够的测量信号，应采用较大狭缝。在定性分析时，为了提高分辨率，应采用较小狭缝，以获得精细的光谱结构。
3.吸收池的选择和使用
吸收池的规格应根据被测溶液颜色深浅来确定，一般是被测溶液颜色深时选光程短的，颜色浅时选光程长的，同一实验使用同一规格同一套吸收池。在定量测量之前需要对吸收池作校正和配对工作，吸收池不匹配时，对测量产生误差，吸收池方向不同，透光率亦有差异，使用时应注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一个箭头，应与光路保持一致。另外，使用时，不要把溶液注得太满，以防在推动比色皿架时溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再测，否则将产生误差。
分光光度计的正确使用和保养也很重要，我们应该做到以下几点:坚持标准溶液现用现配，不使用过期溶液，比色皿应保持清洁、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面；防止仪器振动，影响测量稳定性;在开机状态，不测量时，应打开样品池门，延长光电传感器寿命；样品集中测量，避免开机次数，延长光源寿命；一旦停机，则应待灯冷却后再重新启动，并预热15min左右再使用；要经常更换仪器的干燥剂，防止光学元件和光电传感器受潮生霉；仪器搬动或更换重要部件后，要重新进行性能确认，以保证测量结果的准确。
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