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高速冷冻离心机在分离细胞核基质中的应用冷冻离心机如何做好保养

时间：2020-07-10 来源：仪多多仪器网作者：仪多多商城

核基质是指真核细胞间核中除核被膜、染色体和核仁以外的一个精密网架系统，既包含蛋白质，又包含RNA。核基质是从纯化的细胞核中分离的。要用去污剂、核酸酸处理细胞核。以分离核基质的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。

本文介绍1986年Comerford使用过的分离细胞核基质的方法和步骤。

1. 大鼠肝脏(50~100g)剪碎，加3倍体积的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)。匀浆后通过几层纱布过滤，在4℃，匀浆液以800gmax(用的是MSE Chilspin离心机，4*100ml转子，2100r/min)离心10分钟。把沉淀重新悬浮在匀浆缓冲液里，该缓冲液包含56%(质量浓度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速离心机，A641转子，28000r/min)离心90分钟。把沉淀用20mL匀浆缓冲液洗两次。

2. 把细胞核沉淀重新悬浮在20mL STEM缓冲液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)]，加入四硫酸钠，终浓度为0.2mmol/L。在4℃孵育后，加入N-乙酰马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)，终浓度为5mmol/L。

3. 在800 gmax离心沉淀细胞核，并用20mL STEM洗三次，把细胞核重新悬浮在20ml STEM中，补加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I)，在37℃孵育20分钟，再在800 gmax离心回收沉淀。

4. 把沉淀悬浮在20mL LS缓冲液里[LS缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)] ,在4℃孵育10分钟, 再在800 gmax离心10分钟回收沉淀。

5. 把沉淀重新悬浮在1mL 含有70%(质量浓度)蔗糖的LS缓冲液里。上面铺放3层蔗糖梯度，各2ml 60%，50%和40%(质量浓度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS缓冲液配制蔗糖溶液)。在800 gmax离心1小时，细胞核基质在40%和50%蔗糖分离界面。回收后用STEM缓冲液(10ml)洗一次。

该方法可用于各种类型细胞核基质的分离。

　高速冷冻离心机仪器的故障分为必然性故障和偶然性故障。必然性故障是各种元器件、零部件经长期使用后，性能和结构发生老化，导致仪器无法进行正常的工作;偶然性故障是指各种元器件、结构等因受外界条件的影响，出现突发性质变，使仪器不能进行正常的工作。出现故障的原因分为以下几种。

1.仪器设备质量缺陷引起的故障这类故障是由仪器元件(图示94)质量不好、设计不合理、装配工艺上疏忽造成的故障。

2.高速冷冻离心机人为引起的故障这类故障是由于操作不当引起的，—般多由操作人员对使用程序不熟练或不注意所造成的。故障轻者导致仪器不能正常工作，重者可能损坏仪器。因此在操作使用前，台式低速大容量冷冻离心机毛细管等速电泳必须仔细阅读仪器使用说明书，掌握正确的使用操作步骤’才能减少这类故障的发生。

3.外因所致的故障这类故障是由仪器设备的使用环境条件不符合要求引起的，常常是造成仪器故障的主要原因。一般指的是电压、温度、湿度、电场、磁场及振动等。

4.高速冷冻离心机长期使用后的故障这类故障与元件使用寿命有关，因各种元件衰老所致，所以是必然故障，如光电器件、显示器的老化、传送机械系统的磨损等。

冷冻离心机的维护方法

冷冻离心机是为了保持样品的生物活性而设计的，一般转速不会太高，所用角式转头多采用用钛合金或铝合金制成。主要用于收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸沉淀物以及免疫沉淀物等。冷冻离心机因稳定的性能，精细的做工，巧妙的设计赢得了众多客户的青睐。为保障离心机的正常运行，应清楚知道以下几点。

　　1、离心完毕后要擦干离心腔内水分，定期对电机主轴的锥面上涂少许中性润滑油脂保护，防止转轴锈蚀。较长时间不使用，应将冷冻高速离心机的转子取出，擦干净放置在干燥的地方，防止锈蚀。

　　2、不得随意增加离心机的转速，在使用6个月后，必须进行全面保修一次，离心机长时间不使用或者维修时应将电源插头取下。否则仪器会带电，特别是维修时易发生安全事故。

　　3、冷冻高速离心机为了保护制冷压缩机，仪器断电与通电间隔时间必须大于3分钟，否则损伤压缩机。

　　4、离心机在未使用时，建议打开顶盖，保持离心腔干燥，转子不用时应从离心腔内取出，及时用中性洗涤液清洁擦干，防止化学腐蚀，存放在干燥通风处。不允许用非中性清洁剂擦洗转子，不允许用电热风吹(烘)干转子。转子中心孔内应涂少许润滑脂保护。

　　5、为保证冷冻效果，当环境温度高于30℃时，应对转子和离心腔预冷，转子还应降低转速15%运转。

6、离心管应定期更新，严禁使用濒临破裂的离心管。

　　7、离心机转子使用时一定要确认设置的转子号正确无误。若转子号设置错误。会造成转子超速使用或达不到所需的离心效果。特别是超速使用可能发生转子炸裂的恶性事故，万万不可疏忽大意。

　　8、每次使用前应注意检查转子有无腐蚀点和细微裂纹，禁止使用已腐蚀或有裂纹的转子，使用超过保质期的转子，以保障人身安全。

　　9、聚丙烯(PP)离心管(瓶)不能与王水、甲苯、苯、汽油、煤油等接触使用。超净工作台聚碳酸酯(PC)离心管(瓶)不能与盐酸(30%、50%)、硫酸(10%)、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化氨、氟化铝、硫化铵、醋酸铵、碳酸铵、铬酸(50%)、甲苯、苯、汽油、乙醛、丙酮、乙醇、异丁醇、甲酚等接触使用。聚乙烯(PE)离心管(瓶)不能与硫酸(50%、75%)、苯、汽油、煤油等接触使用。