紫外分光光度计测定蛋白质的含量 光度计技术指标

    分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点。

    通常所测样品溶液浓度下限可达10-6~10-5mol/L，适用于测定食品中的微量组分（如肉制品中的亚硫酸盐、糖果中的二氧化硫等）。

    原理

    物质对光的选择性吸收

    当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。

    若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。

    溶液颜色的产生

    当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过溶液。

    透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。

    人把自身能感觉到的光定义为可见光。

    在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。

    透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。

    光吸收的本质

    当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”;

    光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能太（激发态），这个作用称为物质对光的吸收。

    被激发的粒子约在10-8s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。

    分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量hυ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时，才能发生吸收。

    不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。

    所以物质对光的吸收具有选择性。

    吸收曲线

    吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。

    将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度）；

    然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。

    不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度增加而增大，但最大吸收波长不变。

    若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。

    因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。

    光吸收基本定律

    即朗伯-比尔定律：

    当一束平行单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。

    溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。

    该定律是紫外可见分光光度法等各类吸光光度法定量分析的依据，是由实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质。

    A=lg(I/I0)=εbc

    A-吸光度；

    I0-入射光强度，cd；

    I-透射光强度，cd；

    ε-吸光系数，L/(mol˙cm)；

    b-液层厚度（光程长度），cm；

    c-有色溶液的浓度，mol/L。

    其物理意义为：

    当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。

    式中ε是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在1cm光程中的吸光度。

    ε是吸光物质吸光能力的量度，ε值越大，方法的灵敏度越高。

    由实验结果计算ε时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上时表观摩尔吸光系数。

    在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

    透光度T是透射光强度I与入射光强度I0之比，即：

    T=I/I0

    因此：A=lg(1/T)

    事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值可以在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值;混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

    除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

    蛋白质的直接定量(UV法)

    这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，较佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单;但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰;另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

    比色法蛋白质定量

    蛋白质通常是多种蛋白质的混合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨酸，丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。