液相色谱法(HPLC)是目前应用广泛的分析、纯化、分离有机化合物的有效方法之一。 当今社会中约有80%的已知有机化合物能用液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合热稳定性差、气化挥发困难、沸点高的有机化合物和生命物质。液相色谱仪经常应用于环境分析、食品分析、生命科学、分子生物学、临床药品检测分析等领域。
液相色谱仪由温度控制系统、进样系统、高压输液泵等组成，是利用被检测物在两种液体之间分配比的差异，对被检测物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
通用仪器作为国内液相色谱仪的品牌一直坚持研发生产出更好更准确的液相色谱仪。他的液相色谱仪产品都拥有自己的技术以及产权。具有：压力实时检测显示，高压限、低压限报警，随系统压力变化流速自动补偿的功能；以及确保检测器低噪声、低漂移、超高灵敏度、提高了图谱的分辨能力和准确率的能力。
武汉集思仪器可以使您用低廉的价格购买到通用仪器的液相色谱仪产品。武汉集思仪器设备有限公司致力于打造世界先进水平又适合国内的实验室设备，致力于为您度身定制系统的实验室整体解决方案，是华中地区规模型实验室服务一站式供应商，已为超过5000个国内知名企事业单位提供专业实验室仪器设备。
蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介！
1、纯化的一般目标和方法
首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
然后进行捕获色谱(capture chromatography)，主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography)，目的是去除较难去除的杂质，此步关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。
后为了得到符合要求的终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。
2、纯化前的准备工作
(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)
b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)
c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)
d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第1步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)
(3)样品的保存条件：短期储存(小于24小时)
a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)
a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者hao冻干(真空冷冻干燥)保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立
a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。
c、样品复杂度检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。
4、蛋白质的来源
(1)天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
(2)重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：
a、细胞质：在种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等，色谱柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到较佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构及装填技术。
1.高效液相色谱柱的保养
色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是较佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。我们在对色谱柱使用前进行测试以后，我们要根据不同的情况对色谱柱进行保养：
①反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
②长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度可以是室温.
2.高效液相色谱柱的维护
我们在使用新的色谱柱应该在我们自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。而且在使用的过程中常常有堵塞的现象，造成这种现象的主要原因是
①溶剂中的不溶物；
②样品中的不溶物；
③泵进样器等中的不溶物；
④柱内不溶物的形成等。
如果当色谱柱堵塞以后我们可以对色谱柱进行修复，首先，使用含盐缓冲液后（如离子对试剂）应用溶解性强的溶剂（如水）进行冲洗。其次，先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗，对于反相色谱柱，可使用甲醇、乙睛、四氢呋喃、氯仿、庚烷等，在此条件下，应避免溶剂的pH低于2或高于8。最后如果经过上述还是没有修复，色谱柱压力还是没有下降，则要断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压，若压力稳定下降，则保持色谱柱反方向连接，用低于0.5ml/min流速冲洗一小时。如果压力不下降，则要看内置过滤器是否被堵塞，如果被堵塞应冲洗或更换，若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。而且修复的厚度是2-5mm
3.高效液相色谱柱的维护与保养在液相色谱仪中的应用
高效液相色谱（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的分离分析技术，是现代分离测定的重要手段。问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析。高效液相色谱柱是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行彻底清洗和再生，不同的色谱柱清洗方法各不相同比如：
3.1正相柱分别用正己烷（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级），甲醇（HPLC级）等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积（异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高）.注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。
3.2反相柱分别用甲醇:水=90:10，纯甲醇（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级）等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积.然后再以相反的次序冲洗。
3.3离子交换柱长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。
通过本文希望大家对高效液相色谱柱的保养和维修方法有所了解。
449717568