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前言
目前市面上商品化的反相色谱柱各式各样，时常让实验人员眼花缭乱，产生幸福的烦恼，很难快速选择合适的色谱柱。通常我们会从键合相类型、键合相在硅胶表面的覆盖率、是否封端、封端类型等方面去选择反相色谱柱。本文从已表征色谱柱的参数，通过量化数值去快速选择合适的反相色谱柱。
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色谱柱表征体系
色谱柱表征体系通过量化分析色谱柱中影响溶质保留行为的特征，对色谱柱进行分类，从而指导实际工作中色谱柱的选择。有效的色谱柱表征体系应具有以下特点：
（1）考虑了对色谱柱选择性有贡献的所有因素；（2）每一个柱参数表征一种专属的溶质—色谱柱相互作用；（3）能够得到da部分商业柱的色谱柱参数；（4）对于特定色谱柱，不同实验室能够得到 可重现的色谱柱参数；（5）在特定实验条件下测定的色谱柱参数能应用到任何流动相或任何柱温下的分离。
目前国际上比较成熟的色谱柱表征体系有4个，分别是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色谱柱工作小组领导完成。其中，由Snyder等基于反相色谱保留机制提出的疏水消除模型，理论基础较坚实，对色谱柱选择性的表征较全面，与其余3个体系的柱参数本质上并无区别，均取自代表性溶质的保留值，参数测定方法简便，实现选择相似或者不同色谱柱的目的。由于USP网站公开常用色谱柱的参数，USP方法表征的色谱参数更方便我们筛选色谱柱。
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色谱柱表征参数
对于反相色谱柱选择性主要为疏水作用、立体选择性和氢键作用，还有一些二级作用，比如：离子交换、金属螯合作用等。
3.1 USP数据库
疏水作用（Hy）：通过同yi流动相体系，在不同的反相色谱柱对进行乙基苯测试，考察乙基苯的保留因子，保留因子越da，色谱柱的疏水作用越强。
立体选择性（TFA）：通过同yi流动相体系，在不同的反相色谱柱对进行阿米替林测试，考察阿米替林的拖尾因子，由于阿米替林特殊的立体结构，拖尾因子越小，色谱柱的立体选择性越强，同时硅醇基作用较弱。
金属杂质含量（CTF）：色谱柱中会残留少量的金属离子，一般金属离子会与喹啉结构发生螯合作用，导致峰拖尾，故喹啉拖尾因子越da，色谱柱金属杂质含量越da。
氢键作用（CFA）：阿米替林是碱性化合物，在酸性或中性条件下呈离子态，保留因子较小，保留主要依靠氢键作用，阿米替林保留因子越da，色谱柱氢键作用越强。
3.2 PQRI数据库
疏水作用（H）：通过同yi流流动相体系，在不同的反相色谱柱对进行戊基苯和丁基苯测试，考察乙戊基苯和丁基苯的保留因子之比，比值越da，色谱柱对不同碳链长度化合物的选择性越强，疏水作用越强。
立体选择（S）：区分平面结构（三苯乙烯）和空间体积较da 的结构（邻三苯基）的能力。前者与后者保留因子之比体现空间选择性，比值越da，立体选择越强。图示见图1。
氢键作用（A或B）：通过同yi流动相体系，在不同的反相色谱柱测试咖fei因和苯酚保留因子比值，数值越da，氢键作用越强。PQRI数据库进一步将氢键能力描述为氢键酸度(A)、非电离硅烷与碱相互作用的能力和氢键碱度(B)、硅胶表面或键合相与酸性分析物的特性进一步相互作用的能力。
离子交换作用（pH2.7或7.0）：在流动相pH2.7和7.0下，分别测试苯苄胺和苯酚保留因子之比，比值越da，说明色谱柱区分极性化合物的能力越强。
固定相类型：A——A型硅胶，无定型硅胶，表面残余da 量硅醇基；B——B型硅胶，球形高纯硅胶，目前主流硅胶类型，硅醇基残留少；E——键合相含嵌入极性基团的固定相；phenyl——聚苯乙烯聚合物固定相；F——氟代固定相。
对比USP与PQRI的数据信息，PQRI数据库的色谱柱参数更加全面反应色谱柱的性能。
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案例
目前色谱柱公司均推出各自方法开发的推荐色谱柱包，比如Waters公司推出经济实惠型的色谱柱包：XBridge C18，XBridge Shield RP18、CORTECS C18+、Xbridge Phenyl和Xselect HSS PFP。通过PQRI数据库检索。
从上表可知：
①疏水作用CORTECS C18+＞XBridge C18＞XBridge Shield RP18/Xselect HSS PFP＞XBridge Phenyl，XBridge Shield RP18的键合相含内嵌极性基团，碳载量相对低，苯基柱和五氟苯基柱比C18柱碳载量低，故H值较低。
②空间选择性，Xselect HSS PFP较为突出，CORTECS C18+低，S值反应硅胶表面键合相的密度。Xselect HSS PFP柱的空间选择性强。
③氢键作用，XBridge Shield RP18和苯基柱突出，XBridge C18低，XBridge Shield RP18内嵌的酰胺基团和苯基与酸性和碱性分析物均有强偶极作用。这两根柱子可以分离强极性化合物。
④离子交换作用，在酸性和中性条件下五氟苯基柱的离子交换能力突出，对苯环不同取代物的相似物质选择性强，CORTECS C18+柱在中性条件下离子交换作用强，其对酸性化合物增强保留，对碱性化合物有较好的峰型。
这四款反相色谱柱，各具特点，在分离不同特点的化合物时具有各自的特长，在方法开发中他们可以互补，可提高柱筛选的效率。
在实际工作中，有好多方法有指定的色谱柱，但我们在研究过程中，会找性能相似的色谱柱作为备选色谱柱。可以通过PQRI数据库查找与目标色谱柱相似的色谱柱，只要F值在3以内，均可尝试。比如方法中规定选用Nucleodur C18 Gravity，一个小众品牌的色谱柱，如果想替代之，可从数据查询与之类似的色谱柱。
从上可知：与Nucleodur C18 Gravity相似的色谱柱很多，有我们熟悉的Waters Cortecs C18、岛津Inertsil ODS-2和Kromasil C18，并且完全替代Nucleodur C18 Gravity使用的概率很高。
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小结
反相色谱柱表征体系逐渐成熟，并且广泛地用于筛选色谱柱。根据da 多待测物质性质结合色谱柱参数可快速筛选目标色谱柱。但色谱柱表征体系针对特定样品中难分离物质对的分离，还有待细化。对于结构类似待测物的分离只和部分关键色谱柱参数有关。因此，如何更好地研究难分离物质与关键色谱柱参数的关系，并针对品种在液相色谱方法中规定关键柱参数的zui佳范围，还需要研究者的不断探索。
色谱柱的安装：
（1）拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、 尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
（2）拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
（3）按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。
色谱柱的储存:
1．防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。
2．尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴比较好）中，避免在缓冲溶液中保存。
3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂储存。
4．避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。
5．将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。
说到混合型液相色谱柱，它是一种能够发生多种相互作用模式的色谱柱，作为色谱分离的核心，在目前的液相色谱分析中发挥着重要的作用。混合模式的色谱柱也是种类繁多，有双重混合模式的，也有三重混合模式的。双重混合模式包括：反相+阳离子交换，反相+阴离子交换，反相+HILIC等。三重混合模式包括：反相+阳离子交换+阴离子交换，HILIC+阳离子交换+阴离子交换等。
混合模式色谱柱由于其多种优点，实验人员在分离复杂样品时，越来越多的被使用到实验中，赛默飞拥有的三重混合模式Trinity系列色谱柱在单次运行中可同时分离离子和疏水性分析物，消除了更换色谱柱，使用离子对或使用多种色谱填料的需要。
来来来
我们来隆重介绍一下Acclaim Trinity系列色谱柱。Acclaim Trinity系列均为三重混合模式的色谱柱。又分为P和Q两个系列，均采用纳米微球-硅胶杂化技术，一个颗粒上集成了三种分离模式。P系列色谱柱可以同时分离阳离子、阴离子和非极性化合物。Q系列先卖个关子~
图1. 纳米微球-硅胶杂化技术
（点击查看大图）
新型Nanopolymer Silica Hybrid（NSH）技术在对以下物质分离时可以获得无可比拟的色谱性能：
01 | 原料药和反离子 |
02 | 药物反离子的筛选 |
03 | 酸性和碱性原料药及各自反离子的混合物 |
04 | 酸性、碱性和中性原料药的混合物 |
图2. Trinity P1柱和Trinity P2柱对比
（点击查看大图）
使用与维护
当次使用新的色谱柱时，在进行任何进样之前，应采用流动相进行彻底冲洗（例如，在推荐的流速，大约使用 20 柱体积）。
当切换到新的流动相时， 确保新的流动相与色谱柱中以前的流动相相容，以避免由于沉淀造成色谱柱堵塞。在进行任何进样（例如 20 个柱体积）之前，应完全调节色谱柱。
使用色谱柱前，需要把系统里置换为含有盐的水相和有机相。保证色谱柱一直在带有缓冲盐的体系下使用，是对色谱柱较好的维护。
色谱柱清洗
对于磷酸盐缓冲液中使用的 3.0 mm 内径色谱柱：
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在 0.3 mL/min 流速时，使用 5 个柱体积的 20 mM 磷酸钠（或钾）缓冲液， pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色谱柱。
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在 0.3 mL/min 流速时，使用 20 个柱体积的 100 mM 磷酸钠（或钾）缓冲液， pH 值 6 / 乙腈 v/v 90/10 清洗色谱柱（以强力清除滞留的离子物）。
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在 0.3 mL/min 流速时，使用 5 个柱体积的 10 mM 磷酸钠（或钾）缓冲液， pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色谱柱。
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在 0.3 mL/min 流速时，使用 20 个柱体积的 10 mM 磷酸钠（或钾）缓冲液， pH 值 6.4 / 乙腈 v/v 20/80 清洗色谱柱（以强力清除滞留的疏水污染物）。
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使用至少 20 个柱体积流动相平衡色谱柱。
典型应用
图3. Trinity P1柱分析氯酸盐和高氯酸盐
图4.Trinity P1同时分离药物反离子
图5.Trinity P2柱分析药物相关阴离子和阳离子
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