做液相色谱的同学基本都会碰到分叉峰,很多时候,这都意味着硬件或者方法某些地方可能出现问题。今天我们就一起看看导致峰分叉的原因,以及如何解决这个问题。
首先,我们需要判断这到底是一个峰,还是两个峰?
A图主峰前面有一个肩峰
这到底是峰形不好,还是另外一个化合物没分开呢?
判断方法:降低该成分在样品中的浓度
B图是降低该成分浓度后进样后得到的色谱图,如果这是一个峰那肩峰也应该响应变小,但是这个例子里,肩峰没有变小这应该是另外一个化合物。这时候,我们就要考虑如何改变方法,将这两个东西分开。
如果所有峰的峰形都不好
一般来说,一个样品都会出多个峰,绝大多数时候在每个峰上面都出现肩峰比如像下面这样:
这种情况一般都是管路连接、液相色谱柱头塌陷或者柱头的筛板被堵导致的。
如何解决液相色谱柱头筛板被堵的问题呢?
01反冲
柱出口放空,冲20-30ml流动相。虽然液相色谱柱上都有表明使用方向,但是对于硅胶基质的色谱柱基本都可以反冲。
将柱头污染物如泵密封圈的碎屑,样品中的污染等冲走,就能解决问题。
02更换或清洗筛板
现在估计做这个事情的人不多,但是如果有废的液相色谱柱,想练练也未尝不可。将筛板取下来,用超声波清洗器清洗,晾干后安装;如果清洗后依然没有效果则需要更换新的筛板。
当然,还是要提倡大家注意样品上机之前的前处理和及时更换磨损的泵密封圈。有条件的还是用保护柱,大不了就换保护柱,也比换色谱柱成本更低。
液相色谱仪根据固定相是液体或是固体,又分为液-液色谱及液-固色谱。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较,具有高效、快速、灵敏等特点。
1、 泵。
泵是液相色谱仪的心脏。处于良好工作状态的泵,基线平稳,保留时间重现性好,梯度洗脱时压力变化缓慢而且平稳。
1)选择优质的溶剂和试剂,在进入仪器前用 0.45um 膜过滤,并进行脱气处理。
2)泵开始使用时,一定要用合适的流动相彻底清洗干净。
3)定期检查并更换在线过滤片及有关的垫圈,经常清洗进液处的微孔滤头。
4)改变流动相时,应注意沉淀的产生,以防止泵堵塞。
2、色谱柱。
色谱柱是化合物分离的关键。保养良好的色谱柱具有很高的塔板数,基线平稳。
1)色谱柱比较娇气不能够碰撞、弯曲或强烈震荡;安装时要保证阀件或管路的清洁。
2)流动相在使用前必须进行脱气处理,尽量不使用或少使用高粘度的流动相。
3)在满足灵敏度的前提下,尽可能的使用小进样量。如果样品比较脏,要进行净化或提纯处理。
4)分析结束后要清洗掉进样阀中残留的样品,并用流动相或适当的溶剂清洗色谱柱。
5)如长期不用,用适当的有机溶剂保存并封闭或定期补充合适的流动相。
3 、检测器
分析完成后,马上关闭检测器。
4 、进样器
分析结束后反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染或堵塞。
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 液相色谱柱的安装: 1、液相色谱柱的结构: a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。 在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。 b、柱填料: 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 ?m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 ?m之间。液相色谱柱的安装