液相方法开发攻略
弹：实现保留
今天要为大家带来一个新干货系列——液相方法开发攻略！
在进行液相色谱分析时，我们通常有以下诉求：
而在液相分析工作中，液相方法的开发一直是一项比较具有难度的工作，不论是新手小白，还是有经验的实验室老师，在面对新项目的方法开发时，总会遇到一些问题。
因此，YoYo特意把大曹三耀技术中心多年来积累总结的经验，梳理汇总为这一系列液相方法开发攻略，并将围绕以下四个方面展开介绍：
★ 实现保留
★ 实现分离
★ 峰形和理论塔板数
★ 寿命
今天先来介绍重要也是关键的弹——实现保留，后续几篇将在今后陆续推送，敬请期待哟~
由于大部分化合物都可以在反相分析模式下，使用反相C18色谱柱进行分析与保留，因此，在建立新方法时，反相C18色谱柱也是优先选择的色谱柱。一般可以按照以下步骤进行调整：
反相C18柱初筛 看是否有保留
提问：方法初筛时，选择什么样的C18色谱柱比较好？
YoYo老师：选择一款普适型色谱柱，要求硅胶纯度高、金属杂质低、具有适中的疏水性与表面极性，能分析大多数常规化合物，峰形好、寿命长，分离度高，柱效高~
这些要求很过分吗？不！
这是我们对CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱的基本要求！
CAPCELL PAK C18 MGII
CAPCELL PAK C18 MG系列色谱柱凭借填料表面致密的聚合物包被技术，极大程度地抑制了硅胶基材的金属杂质及残留硅醇基等不良影响，CAPCELL PAK系列色谱柱具有以下特长：
★ 极大限度地减少配位化合物的吸附
★ 极大限度地抑制残留硅醇基的二次效应
★ 优越的耐酸、耐碱性能
★ 能得到对称性良好的色谱峰
★ 具备良好的保留与分离能力
其中，CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱是普适性很强的C18色谱柱，可以满足大部分化合物的分析需求。
那么，在经过C18色谱柱初筛之后，还是发生了保留不充分的情况，应该如何调整分析方法来实现保留呢？
1
调整pH值
在反相模式下，对于不同性质的化合物也应采取不同的流动相条件及相应色谱柱。例如，酸性化合物在酸性条件下保留较强，碱性化合物在碱性条件下保留较强，利用这一性质，调整适合的pH值，并选择相应适合的色谱柱，即可达到良好保留结果。
在设定流动相pH时需要注意：离子性化合物可能会由于流动相pH值设定的不合理而发生漂移，建议将流动相的pH值设定在化合物的pKa±2以上范围。
2
更换保留模式
如果调整流动相pH也不能解决保留问题，该化合物可能不适合在反相模式下进行保留和分析，这时，可以考虑更换保留模式进行进一步的方法摸索。
★ 离子交换模式（离子对试剂、离子交换柱）
★ HILIC模式
★ 正相模式
色谱柱的选择
对于强极性、小分子类化合物，可以使用高极性反相柱或在HILIC模式下进行保留尝试
★ 高极性反相柱：AQ、ADME
★ HILIC（亲水性相互作用）柱：PC HILIC、NH2、SILICA
对于酸性化合物，可以使用阴离子交换柱或反相柱+正离子对试剂的方法，使酸性化合物处于分子态，利于增强保留
★ 阴离子交换柱：NH2
★ 反相柱+正离子对试剂：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
对于碱性化合物和两性化合物，可以尝试使用阳离子交换柱或反相柱+负离子对试剂的方法，使碱性化合物处于分子态，增强保留
★ 阳离子交换柱：SCX、CR
★ 反相柱+负离子对试剂：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
分离模式选择例
接下来，YoYo将以三聚氰胺的分析为例，对保留困难的化合物的方法建立进行说明。
三聚氰胺俗称蜜胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为重要的氮杂环有机化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加剂，pKa=8，属于弱碱性化合物。
三聚氰胺
Melamine
M.W. :126.12
（一）离子交换模式
在离子交换模式下进行分析，能对三聚氰胺得到良好保留。具体做法可分为以下两种：
1. 反相色谱柱 + 离子对试剂
▲CAPCELL PAK C18 MG+离子对试剂
HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):
Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 40°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
2. 离子交换色谱柱分析
▲CAPCELL PAK SCX色谱柱
HPLC Conditions:
Column: CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm
M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 30°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
CAPCELL PAK SCX
CAPCELL PAK SCX是一款解决了传统硅胶系离子交换柱存在的问题的聚合物包被型强阳离子交换色谱柱。在精密分级的5 μm的高纯度硅胶上形成高分子聚合物包被后，导入磺酸基。聚合物包被型的Si-C结合比一般的化学结合型硅胶系SCX的Si-O-Si结合更稳定，耐久性更强。
★ 通过强阳离子交换作用和疏水性相互作用的共同保留机制来进行保留
★ 批次间重现性良好
★ 耐久性强
不论是反相柱+离子对试剂，还是使用离子交换色谱柱进行分析，都会发现色谱柱平衡时间对保留时间的影响。在离子交换模式下进行分析时，需要充分平衡色谱柱，建议小流速过夜平衡，可以得到比较稳定的实验结果。
（二）高极性反相色谱柱
键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME色谱柱，兼具高表面极性和一定的疏水性，不仅适用于强极性物质的保留，也适用于强极性物质和疏水性物质的多组分共同分析。
使用键合独特金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME色谱柱，在简单的2%甲醇条件下即可实现三聚氰胺和双氰胺的良好保留与分离。这得益于ADME色谱柱独特的表面极性与保留模式。
▲CAPCELL PAK ADME分析三聚氰胺与双氰胺结果
*峰1：双氰胺，峰2：三聚氰胺
HPLC Conditions:
色谱柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流动相：2% CH3OH
流 速：1000µL / min
温 度：35°C
检 测：PDA210 nm
进样量：5 µL
样 品：10 μg/mL（流动相溶解稀释）
CAPCELL PAK ADME
CAPCELL PAK ADME色谱柱采用独特的立体笼状金刚烷基官能团——ADME官能团，突破了以C18官能团为主的传统柱在反相保留机理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的极性范围得到了巨大的提升；并且，在极性提升的同时还兼顾一定的疏水性；从而，包含从强极性化合物到疏水性化合物的复杂组分样品在ADME上也能同时得到良好的保留。
★ 立体笼状金刚烷基官能团——独特的独特的表面极性与疏水性平衡
★ 高表面极性——对强极性化合物的良好保留
★ 兼顾一定疏水性——从极性到疏水性化合物的共同分析
★ 立体选择性——空间异构体拆分能力
ADME(adamantane)金刚烷，我们将这种笼状结构的金刚烷基团以控制的键合密度导入填料表面，通过“新型官能团”和特有的包被型填料表面“控制技术”，我们将保持疏水性又提高表面极性变为可能；由于金刚烷特有的笼状结构所带来的立体选择性，还赋予了ADME分离结构类似化合物的能力。
（三）亲水性相互作用 HILIC模式
亲水性相互作用色谱法（HILIC）是针对在常规C18色谱柱上保留较弱的强亲水性物质的保留方法。在HILIC模式下，通过键合极性官能团的固定相与反相模式常用的CH3CN / H2O系流动相条件相组合，对亲水性化合物进行保留与分离。因此，HILIC是在HPLC的分离模式中常使用的反相模式的反相，故也被称为“反反相模式”。
大阪曹達独立研发合成了构成细胞膜的主要磷脂类物质之一的卵磷脂亲水性部位——PC基团（磷酸胆碱基团），作为PC HILIC色谱柱的官能团，对亲水性化合物的保留具有优势。
如下图，使用PC HILIC色谱柱和另一款其他品牌色谱柱Column B进行对比，对三聚氰胺进行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）条件下，PC HILIC色谱柱所得保留时间更长，理论塔板数更高，即使是在水相比例为20%时，也得到了足够的保留。
▲PC HILIC色谱柱在不同条件下分析结果
HPLC Conditions：
Column : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mm
Mobile phase : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : 40 ˚C
Detection : UV 235 nm
Inj. vol. : 10 μL
Sample dissolved in: Mobile phase
PC HILIC
大阪曹達独立研发合成了构成细胞膜的主要磷脂类物质之一的卵磷脂亲水性部位——PC基团（磷酸胆碱基团），作为PC HILIC色谱柱的官能团，对亲水性化合物的保留具有优势。
★使用超亲水性的磷酸胆碱基团作为官能团的HILIC色谱柱
★随乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈
（四）LC-MS分析——混合模式保留
MS检测对流动相的要求：
★ 不含离子对试剂
★ 挥发性盐，低浓度
阳离子交换填料柱 + 挥发性盐溶液（低浓度）
SCX + C18 = CR ！
在以MS检测器进行分析时，流动相条件会对灵敏度产生很大影响，CAPCELL PAK CR色谱柱混合了C18和强阳离子交换SCX填料，即使对多种碱性化合物进行同时分析，也能兼顾对保留和MS检测灵敏度的要求。
如上图，在中性条件下：
● C18色谱柱：中性化合物得到保留，酸性、碱性化合物快速出峰；
● SCX色谱柱：碱性化合物得到保留，中性、酸性化合物快速出峰；
● 混合了两种填料的CR色谱柱：碱性化合物得到保留，中性化合物能得到适度保留，酸性化合物依然快速出峰。
此时，只需将流动相条件调整为酸性，即可在CR色谱柱上同时保留这三种类型的化合物：
HPLC Conditions：
Column ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mm
Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,
25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50
Flow rate ：200 µL/min
Temp ：40 ℃
Detection ：UV 240 nm
Injection ：2 µL
Sample ：10 µg/mL
CAPCELL PAK CR
CAPCELL PAK CR色谱柱是一款混合C18和强阳离子交换SCX填料的色谱柱。对多种碱性化合物进行同时分析时，能同时兼顾对保留和MS检测灵敏度的要求。
★ 强阳离子交换SCX与C18混合填料
★ 具有独特分离模式
★ 适合于LC-MS的高灵敏度离子化合物分析
★ 可对酸性、中性、碱性化合物进行同时保留
★ 有3种混合比例可供选择
*与武田制药共同开发
通过调整流动相的盐浓度，可在离子交换作用下针对碱性化合物的保留程度进行调整，从而改变分离模式，达到不同极性化合物同时分析的效果。
色谱柱的平衡和使用
反向色谱柱在经过出厂测试后是保存在甲醇(或乙睛)/水中的。请一定确保您所使用的流动相和甲醇（或乙睛）/水互溶。由于色谱柱在运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10-20倍的体积的甲醇或乙睛平衡色谱柱：如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用含水量很高（约95%）的流动相过渡，样品分析完后，冲洗柱子是亦然。过去传统的方法使用纯水冲洗，对于非极性柱，如C8或C18，由于纯水不能浸润填料表面而冲倒碳链，造成柱效下降。另外，分析样品时，由于纯水在填料表面不能浸润形成水膜，出现样品不保留而分不开，重现性差，所以对一般的C18和C8，有机溶剂不能低于5%。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水或甲醇或乙睛的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡。
平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂浓度如果较低，则需要较长的时间平衡）
色谱柱的再生
建议用来冲洗的溶剂体积
| 色谱柱规格 | 柱体积 | 溶剂体积 |
| 150*4.6 | 2.50ml | 50ml |
| 250*4.6 | 5.0ml | 100ml |
| 250*10 | 20ml | 400ml |
请根据下表选择您的再生方法：
极性固定相（如Si,NH2,Diol色谱填料）的再生：正庚烷-氯仿-乙酸乙酯-丙酮-乙醇-水
非极性固定相（如反向填料C18,C8等）的再生：水-乙睛-氯仿（或异丙醇）-乙睛-水
0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
色谱柱的维护：
1、使用保护柱
2、大多数柱的PH稳定范围是2-7.5，尽可能在此范围内使用
3、避免流动相组成及极性有剧烈变化
4、流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5、如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，要在实验完毕将柱子冲洗干净
6、压力升高时更换保护柱
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高效液相色谱仪是进行定量分析，杂质检查等分析工作中主要的精密仪器，色谱柱是液相色谱仪的zui核心部件。
在这里，介绍一下色谱柱使用中的注意事项及使用心得。
1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配
色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多，如果接头和柱头深度匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。
接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。
2、溶剂的匹配转换
色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。
特别是流动村j含缓冲盐时，如保存溶剂足纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接人使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，造成柱头堵塞。建议仪器和色谱柱经常使用，用10％的有机溶剂保持即可。
3、流动相及待测样品的过滤
日常分析工作中，我们使用的流动栩和待测样品应用0．45pm滤膜过滤后再连接或注入到色谱仪上。
对于有机相比例高的流动栩可以一起过滤出来备用，但是有机相比例小的流动相一定要现用现滤，分析结束时一定要先用10％的有机溶剂冲洗管路及色谱柱，为有机相少的流动相容易滋生细菌，造成色谱柱堵寒，影响色谱柱性能。
4、色谱柱分析时应进行平衡和老化
进行的方法是运行几次完整的分析程序(包括进样)，直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，闪扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。
5、pH使用范围
一般认为硅胶基质柱子的pH使用范足2-8，如果选用的是高品质硅胶，加上高密度键合和双封尾，使pH耐受范同zui大提高到lO。
注射用头孢拉定流动村1pH值为8，对色谱柱伤害很大，需要选择pH值耐受性高的色谱柱。
6、峰形异常
峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性。先检查样品足否过载，由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。
如果发现过载，需降低进样量(包括进样体积或浓度)，进样量越小，峰形越好，例子如头孢尼西钠的测定。其次，硅醇基次级保留引起部分峰拖尾。
这种情况发生，选择高密键合和彻底的双蜂尾工艺的色谱柱能改善峰形。另外，溶解样品的溶剂洗脱能力比流动相强会发生峰前延，所以样品zui好选用流动相溶解。
7、色谱柱保存
短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流动相(不含缓冲盐)保存为佳，以尽量减少下次使用的平衡时间。
一般只建议在长期保存反相柱的时候用纯醇或乙腈，使用80％左右有机相保存也属好的选择，且足以避免长菌。
强烈建议在柱身上贴标签标明保存溶剂。离子交换柱和水性凝胶柱等适合保存在水溶液中的色谱柱，可加0．05％化钠溶液防止K菌。正相柱无论是短期还足长期，都推荐保存住所用流动相巾。
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