日立液相色谱只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
日立液相色谱成为解决生化分析问题有前途的方法。由于液相色谱仪具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。日立液相色谱与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。
日立液相色谱常用的脱气方法有以下几种:
1、吹氦脱气法使用在液体中比空气溶解度低的氦气,在0、1Mpa压力下,以约60ml/min流速通入流动相10-15min以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂,脱气效果较好,但在国内因氦气价格较贵,本法使用较少;
2、加热回流法此法的脱气效果较好;
3、抽真空脱气法此时可使用微型真空泵,降压至0、05-0、07MPa即可除区溶解的气体。显然使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化,故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合,以保证混合后的比例不变。
4、超声波脱气法它是目前实验室使用广泛的脱气方法,将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气10-20min即可。该方法操作简便,基本能满足日常分析的要求。
5、在线真空脱气法把真空脱气装置串联到储液系统中,并结合膜过滤器,实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法,并适用于多元溶剂体系。
在日立液相色谱系统开始工作前,可以用注射器连接恒流泵的排空阀,抽入流动相,将流路中的空气驱赶干净。在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。
任何颗粒物进进液相色谱仪后都会在柱子进口端被筛板挡住,zui后的结果是将柱子堵塞,表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此,要采取各种预防 措施,包括操纵步骤和商品仪器自身的各种过滤设计,努力防止或减少颗粒物进进液相色谱仪中,从而延长仪器和色谱柱的使用寿命,并进步数据的可靠性。
在液相色谱仪中,颗粒物的主要来源有三个途径:活动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、被测样品
使用针筒式过滤器不可能100%得到通过过滤器的被测样品,总会或多或少的丢失。丢失来自这样几方面:过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。
2、活动相
无论是液相色谱仪HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水,zui后一步也是通过0.2μm微孔滤 膜。任何一种缓冲液中加进了固体物,必然活动相过滤将。少量杂质颗粒存在于活动相中必然成为残渣。
解决办法:2. 1.活动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤,反之所有活动相组成在使用前必须过滤。
2.2在连接储液瓶和泵的输液管的末端进口采用下沉式过滤器(常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种)也是很重要的。这个过滤器的规格为≥10μm的微孔物质,所以它不能取代活动相过滤步骤,但是它能除往系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。
2.3.推荐在HPLC系统中采用一个0.45 或0.5μm的在线多孔过滤器,接在自动进样器和柱子之间,即使已使用了保护柱。这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板,而且如采用一个玻璃砂芯滤板, 既便宜,更换又方便(几分钟就可更换)。若采用在线过滤,液相色谱仪检测每批样品开始前记录下压力值,当压力上升一定值,例如25%或增加 500psi,应该更换玻璃砂芯滤板了,更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。
3、仪器系统部件的磨损物
zui后,在液相色谱仪HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。
3.1、在一般实验室中输液泵密封垫通常使用寿命为六个月到一年,因此建议半年或一年更换这些密封垫。
3.2、原装密封垫的密封效果,更换以后轻易引起活动相渗漏。所以,只要不漏液就不要轻易更换密封垫。