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三重混合模式色谱柱选赛默飞色谱柱准没错 色谱柱常见问题解决方法

时间:2020-07-24    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

 

说到混合型液相色谱柱,它是一种能够发生多种相互作用模式的色谱柱,作为色谱分离的核心,在目前的液相色谱分析中发挥着重要的作用。混合模式的色谱柱也是种类繁多,有双重混合模式的,也有三重混合模式的。双重混合模式包括:反相+阳离子交换,反相+阴离子交换,反相+HILIC等。三重混合模式包括:反相+阳离子交换+阴离子交换,HILIC+阳离子交换+阴离子交换等。

 

混合模式色谱柱由于其多种优点,实验人员在分离复杂样品时,越来越多的被使用到实验中,赛默飞拥有的三重混合模式Trinity系列色谱柱在单次运行中可同时分离离子和疏水性分析物,消除了更换色谱柱,使用离子对或使用多种色谱填料的需要。

 

来来来

 

我们来隆重介绍一下Acclaim Trinity系列色谱柱。Acclaim Trinity系列均为三重混合模式的色谱柱。又分为P和Q两个系列,均采用纳米微球-硅胶杂化技术,一个颗粒上集成了三种分离模式。P系列色谱柱可以同时分离阳离子、阴离子和非极性化合物。Q系列先卖个关子~

 

  图1. 纳米微球-硅胶杂化技术

(点击查看大图)

 

新型Nanopolymer Silica Hybrid(NSH)技术在对以下物质分离时可以获得无可比拟的色谱性能:

01

原料药和反离子

02

药物反离子的筛选

03

酸性和碱性原料药及各自反离子的混合物

04

酸性、碱性和中性原料药的混合物

 

图2. Trinity P1柱和Trinity P2柱对比

(点击查看大图)

 

使用与维护

 

当次使用新的色谱柱时,在进行任何进样之前,应采用流动相进行彻底冲洗(例如,在推荐的流速,大约使用 20 柱体积)。

 

当切换到新的流动相时, 确保新的流动相与色谱柱中以前的流动相相容,以避免由于沉淀造成色谱柱堵塞。在进行任何进样(例如 20 个柱体积)之前,应完全调节色谱柱。

 

使用色谱柱前,需要把系统里置换为含有盐的水相和有机相。保证色谱柱一直在带有缓冲盐的体系下使用,是对色谱柱较好的维护。

 

色谱柱清洗

 

对于磷酸盐缓冲液中使用的 3.0 mm 内径色谱柱:

1

在 0.3 mL/min 流速时,使用 5 个柱体积的 20 mM 磷酸钠(或钾)缓冲液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色谱柱。

2

在 0.3 mL/min 流速时,使用 20 个柱体积的 100 mM 磷酸钠(或钾)缓冲液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 90/10 清洗色谱柱(以强力清除滞留的离子物)。

3

在 0.3 mL/min 流速时,使用 5 个柱体积的 10 mM 磷酸钠(或钾)缓冲液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色谱柱。

4

在 0.3 mL/min 流速时,使用 20 个柱体积的 10 mM 磷酸钠(或钾)缓冲液, pH 值 6.4 / 乙腈 v/v 20/80 清洗色谱柱(以强力清除滞留的疏水污染物)。

5

使用至少 20 个柱体积流动相平衡色谱柱。

 

典型应用

 

图3. Trinity P1柱分析氯酸盐和高氯酸盐

 

图4.Trinity P1同时分离药物反离子

 

图5.Trinity P2柱分析药物相关阴离子和阳离子

 

  今天有人问,《色谱柱使用记录》表里样品进样针数后面为什么还有个累计进样针数?
 
  套用哲学观点,任何物质都是有寿命的,大到宇宙,小到原子,但是不同的物质寿命是不一样的。
 
  每一根色谱柱都有一个大致的进样针数寿命,理论上可以有一个规定,达到进样多少针,就强制报废。不过好像并没有这样的规定,那么也可以作为一个参考,当色谱柱的柱性能参数(就是常说的理论塔板数、分离度、拖尾因子等等)不达标时,参照进样针数判断是柱子寿命到了,属于不可逆因素,只能换柱子。还是其它原因,如流动相配制错误,或者流动相变质了,也可能稀释液强度太大,也可能是方法就是错的,也可能是样品本身问题。
 
  不过色谱柱的累积性损坏自然不是一朝一夕的事,柱性能是缓慢下降的,但是没有一个特定的标准,要看具体的分析方法,而且跟柱型号也有关系。常规的分析方法下C18柱寿命是很长的,因为C18柱是目前技术zui先进,质量可靠,使用zui广泛的色谱柱,在常规分析方法下,基本上不会损坏。但是如果流动相比较特殊,如高盐、高pH>8、低pH<1、高柱温、高比例水相、高比例有机相等等,色谱柱的损坏就会相应地加剧。
 
  这些可以算作是化学损伤,如果是操作不当,例如,流动相和样品溶液没有过滤,或者撞击色谱柱等,也会造成物理损伤,也会严重影响色谱柱寿命,甚至是“一招毙命”。
 
  前面提到了柱型号,不同型号的色谱柱寿命当然也不一样,跟前面说到的C18类似的,CN柱、苯基柱等键合硅胶柱都具有较长的使用寿命。不过所有基于硅胶基质的色谱柱都有一个天生的弱点,就是硅胶是能被水溶解的,虽然溶解度很小,但是长年累月使用,尤其在反相色谱系统中,累加了高盐、高pH、高柱温、高比例水相等方法参数后,硅胶的流失尤为明显。我做过一个项目,流动相含盐,柱温高达50度,基本上一根色谱柱半年就报废了。不过,是有一种方法可以解决这个问题的,就是在色谱柱前加一个柱芯与色谱柱类型相同的预柱,也叫保护柱,当流动相里溶解预柱里的硅胶饱和以后,就不再侵蚀色谱柱的硅胶,从而大大延长色谱柱寿命。不过不到万不得已还是不要使用特别苛刻的流动相,要知道预柱的柱芯也是很贵的,那就是一根较短的色谱柱啊,就算保住了色谱柱,经常换柱芯也是吃不消的。
 
  但是有一些类型的色谱柱,天生就是短命鬼,例如NH2柱,有时候好不容易平衡好系统,进个几十针样就OVER了,像是一次性的。就像焰火,它华丽的现身,转瞬就湮灭了。这些就留待色谱柱专家们去开发更加稳定可靠的新填料了。
 
  还有一类柱子,就是手性分离柱,这在医药行业是很大的一个应用。通常手性色谱柱是正相柱,这就要求我们在使用手性柱之前要先把系统置换干净,再接上柱子用流动相冲洗平衡进样。通常是甲醇、异丙醇、正已烷+异丙醇、流动相这样的顺序,如果忘记这个过程,会造成很大的麻烦。而且有一些手性柱是涂敷柱,例如淀粉、纤维素等大分子涂敷柱非常怕水,如果系统中原来的反相流动相没有置换干净,就会对色谱柱造成不可逆损伤,甚至报废。近年来,科学家也开发出了键合的手性柱,相比较要稳定的多,甚至也可以应用反相色谱系统。
 
  使用后对色谱柱的冲洗保存也比较重要,使用了缓冲系统的尤其要注意。这里推荐一个反相色谱系统的通用冲洗流程:将所有通道置换成含有较低有机相比例的水相中,比如10-30%乙腈或甲醇,然后冲洗1个小时,然后再梯度增加有机相比例,各冲洗一定时间,终保留在高有机相比例的冲洗液里。低有机相比例的冲洗液是为了尽可能地冲洗缓冲盐。通常低压梯度洗脱的液相色谱仪采用的是四元泵,就是单泵四通道,比例阀混合。这种混合方式有个弊端,就是混合效果差,因为各通道不同比例是通过开关各通道阀的时间来控制的。打比方乙腈:缓冲盐=50:50,如果流速是1.0mL/min,并不是说乙腈和缓冲盐以各0.5mL/min的流速来混合;而是流速一直是1.0mL/min,但是在往复泵一个来回的时间内,两个通道分别打开一半的时间,也就是说系统管道里是一段乙腈、一段缓冲盐。这样就会造成盐的析出。所以,往往是两通道混合,就算没有用缓冲盐,还是建议先按比例混合好了,然后走单通道,否则的话一样会造成盐析出,或者基线波动。走梯度洗脱的话,往往会把有机相通道(B)中加入一定比例的水,或者把水相通道(A)配成梯度洗脱的初始比例,把有机相通道(B)配成梯度洗脱终的比例。
 
  这里有两点需要说明,一,一般认为,色谱系统包括色谱柱的冲洗甚至保存,都可以使用流动相,只是不加缓冲盐、酸碱等。例如上面提到的乙腈:缓冲盐=50:50,做完样品以后,就可以用50%乙腈/水来冲洗保存。有一些品牌色谱柱,例如资生堂,建议如果不是含盐或者强酸强碱,一般不建议冲洗。不过这只适合短期保存,也就是没隔多久又要再次使用。长期不用的色谱系统包括色谱柱还是应该冲洗后保存在高比例低极性溶剂体系中。一般建议正相系统保存在正已烷:异丙醇=90:10,反相系统保存在乙腈:水=90:10或者100%乙腈中。第二,随着快速分离色谱柱的发展,很多的低粒径色谱柱得到应用,而且往往柱温也较高,通常达到50度或以上,这种色谱系统通常柱压也较高,贸然用高比例水相冲洗可能会导致系统超压。可以先用流动相冲洗,或者断开色谱柱,用高比例水相冲洗系统,再接上柱子逐步提高有机相比例冲洗,也可以先调低流速冲洗。而且,待冲洗快要结束时再降低柱温。
 
  下面说说气相色谱柱,现如今填充柱几乎退出了历史,人们说起气相色谱柱自然就是石英毛细管柱。
 
  相比较液相色谱柱,感觉气相柱要简单的多,而且,往往气相柱各型号之间的专属也不那么强,往往一个样品用多种色谱柱分析,通过调整温度程序,也可以得到相类似的分析结果。结合到本文标题,气相色谱柱的进样针数同样也仅供参考,不能作为色谱柱寿命的唯①参数,影响气相色谱柱的寿命的因素基本为高温、高温时间、样品中的高沸物(包括一些在不适合的方法中,样品的分解或聚合物)、载气纯度等。
 
  常规的气相色谱柱通常是石英管表面涂敷的液体填料,所以一般情况下,气相色谱的分离其实是气化后的样品在液体填料里的溶解再挥发的性质不同来实现的。那么既然填料是液体,自然就会挥发了,气相色谱柱的寿命zui大的影响因素就在这里。气相色谱柱都会有一个极限温度,一般使用温度会在这个极限温度下的20度左右。通常气相分析方法是程序升温的,高温的温度和保留时间决定了每一次进样对色谱柱的影响。不过不同类型的色谱柱因为其填料的性质不同,其极限温度也不同,自然zui高使用温度就不同。反过来说,在相同使用温度下,其寿命也不相同。
 
  不管什么分析方法都要尽可能的真实反应样品里的溶剂及所有物质的含量, 气相色谱分析样品的首要条件是,样品要能被气化,就是进样口温度及程序终温要大于样品的沸点(这也不是jue对的),当样品中有高沸点的物质,甚至是无机盐、机械杂质,不能被气化留在了衬管里,甚至留在了色谱柱中,就会对色谱柱有损伤。这种情况是要处理一下样品,萃取、蒸馏、过滤都是常用的方法。如果实在无法避免,就要经常更换隔垫、衬管玻璃毛等,过一定时间还要把色谱柱前段割一段下来,通常是1米左右。除了这些,还应注意对样品性质的了解,如果样品的热稳定性差,进样分析过程中发生了分解或者聚合,产生高沸物就会对色谱柱产生很大影响,如果这些物质不能被溶剂冲洗的话,这种损伤就是不可逆的,而且分析结果也不准确。这种情况下就要适当的降低温度,直到不发生这种反应。或者换其它的分析方法。
 
  通常我们使用的 载气是高纯氮气,原因就两个字——便宜!但是,排除经济因素,这并不是一个zui佳的选择。因为氮气的生产就是液态空气蒸发来的,但是因为氮气和氧气性质接近,一般很难杜绝高纯氮气里含有少量的氧气。氧气在高温柱对整个气相色谱系统包括色谱柱都会产生不良影响。所以一般仪器厂家还是建议使用高纯氦,尤其在进行计量、验证等高标准分析时,不过一瓶高纯氦可以换5瓶高纯氮,一般用户还是选择使用高纯氮气。其实从仪器性能来讲,也可以使用高纯氢气作为载气,低含氧量、低背景、低廉的价格都是不错的选择,当然一般考虑到氢气的泄漏以及储运的风险,往往被用户所排除。不过,带TCD检测器的气相色谱往往还是使用高纯氢气作为载气。
 
  说了这么多,zui后感性的总结一下。真正做仪器分析人,都能发现不同品牌的仪器,甚至每一台仪器的不同,只有你真正热爱仪器分析,把每一台仪器当成好
 
  ------ 责任编辑:瑞利祥合--分析仪器采购顾问
 
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  1.柱物理损坏
 
  色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。的解决方法就是更换新柱。
 
  2.柱内填料污染
 
  流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。
 
  流动相所用的各种溶剂至少是分析纯,尽量使用色谱纯试剂。流动相所用的水要是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。用前先用0.45um溶剂微孔过滤(器)过滤,除去可能存在的微粒。流动相建议现用现配,对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。此外还得保证储存流动相的容器清洁。
 
  复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤(器)或样品预处理柱对样品进行预处理,确保样品中不含微粒杂质。若样品不便处理,要使用保护柱。柱内填料污染时,可将柱头螺丝卸下,用专用工具挖出柱内前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修复。或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向,冲洗色谱柱(约20至30倍柱体积,或视具体情况而定;另外,此时不能接检测器),将污染物冲出色谱柱,再按色谱柱标明的使用方向使用。
 
  3.柱进口处有异物
 
  当断定是柱进口处有异物时,可将柱头螺丝卸下,取出滤帽并将其置于20%硝酸溶液中,用超声波清洗约20分钟,再置于超纯水中,并用超声波清洗约10分钟,重新装入色谱柱内即可。
 
  4.样品浓度过高致使柱超载
 
  样品在柱上超载能引起峰展宽,拖尾(或伸舌)。
 
  适当减小进样量或样品浓度(需要时,可提高检测器灵敏度)直至峰形和保留时间不再改变,便可消除这种不良影响。减小进样量还能改善其分离度。正常情况下,样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3~50ug范围内,不会引起明显超载。
 
  5.样品溶剂不对
 
  选择合适的样品溶剂,以排除不必要的干扰。要选用流动相溶解样品。
 
  6.柱外效应
 
  柱外效应(即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积)是影响色谱柱柱效的主要因素之一。所以在可能的条件下,色谱柱的两端连接管路要尽可能短,连接管内径尽可能细小,切口务必平整光滑,尽可能的减小死体积,以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。
 
  7.缓冲不足或不合适
 
  在缓冲不好或离子强度过低的分离中,也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能改善此情况。
 
  8.硅醇基团作用
 
  仔细分析色谱柱内填料表面性质可知:反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖了一半,其余的就是未被键合的硅醇基团。所谓的保留是指样品分子与键合相相互作用的结果。但是,酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质之间相互作用而引起双重保留机理,因此,发生了峰形拖尾。
 
  为了减小峰形拖尾,通常可在流动相加入25mM三乙胺(抑制剂)。三乙胺能与硅醇基团发生强烈的相互作用,从而降低或阻断样品分子与硅醇基团的作用,以保证保留机理正常进行,并大大缓解了峰形拖尾。使用长链的硅醇基抑制剂,虽起效较慢,但持续力较三乙胺长。因为抑制剂分子中除了胺基与硅醇基团发生极性作用外,大分子中非极性部分与固定相也会发生反相作用而产生保留现象。如果将抑制剂加至样品中,效果会显著。
 
  9.柱内金属污染
 
  柱内金属污染(Fe,Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金属可由填料本身带进,也可由腐蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片,随流动相沉积到柱填料中。例如C18柱填料被金属污染后,造成酸性/碱性样品拖尾,可用碱洗/酸洗后再键合的填料,得到的峰是尖锐且对称的。
 



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