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分光光度计的用途光度计是如何工作的

时间：2020-08-05 来源：仪多多仪器网作者：仪多多商城

一，分光光度计的用途：
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值可以在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
蛋白质的直接定量（UV法）
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，较佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
比色方法
一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。
Lowry 法：以比较早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前，可以是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后1011分光光度计的重要配件—— 比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，可以是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。
细菌细胞密度（OD 600）
实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。
分光光度计的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。
由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
随着科技的发展，现在比色杯已经不是使用分光光度计时的必备物品。目前国外Nanodrop公司（现已被Thermo Fisher公司收购）生产的ND1000分光光度计与旧式分光光度计相比，已经可以做到无需稀释样品，无需使用比色杯，每次测量仅需1-2μl样品即可完成测量。

原子吸收分光光度计的基本构成及部件

原子吸收分光光度计与普通的紫外可见分光光度计的结构节本相同，只是光源用空心阴极灯光源代理连续光源，用原子化器代替了吸收池，所以原子吸收分光光度计主要由：光源，原子化器，单色器以及检测系统和记录显示系统几部分组成（如下图）。

1.光源 光源的功能是发射被测元素基态原子所吸收的特征共振辐射。对光源的基本要求是:发射辐射的波长半宽度要明显小于吸收线的半宽度、辐射强度足够大、稳定性好、使用寿命长。 (1)空心阴极灯空心阴极灯的结构如下图所示。

空心阴极灯有一个由被测元素材料制成的空腔形阴极和一个钨制阳极。阴极内径约为2mm，放电集中在较小的空间内，可得到高辐射强度。阴极和阳极密封在带有光学窗口的玻璃管内，内充惰性气休，根据所需透过辐射波长，光学窗口在370nm以下用石英，370nm以上用普通光学玻璃。空心阴极灯是一种特殊辉光放电装置，放电主要集中在阴极腔内，当在两极上加上200~500V电压时，阴极发出的电子在电场作用下被加速，在飞向阳极的过程中，与载气的原子碰撞并使之电离。荷正电的载气离子又从电位差获得动能，轰击阴极表面，将阴极材料的原子从晶格中溅射出来。溅射出来的原子再与电子、原子、离子等碰撞而被激发，发出被测元素特征的共振线。在这个过程中，同时还有载气的谱线产生。灯内填充气压较低，一般为399.9~798.9Pa，阴极溅射的金属蒸气密度相对于大气压下气体放电而言，也是很低的，因此，谱线的碰撞变宽被限制到了很小程度。灯的工作电流较小，一般为几毫安至20mA，因此阴极温度和气休放电温度都不很高，谱线的多普勒变宽可控制得很小。所以空心阴极灯是一种实用的锐线光源;缺点是测一种元素换一个灯，使用非常不方便。 (2)多元素空心阴极灯多元素灯就是在阴极内含有两种或两种以上不同元素，点燃时，阴极负辉区能同时辐射出两种或多种元素的共振线，只要更换波长，就能在一个灯上同时进行几种元素的测定。缺点是辐射强度、灵敏度、寿命都不如单元素灯，组合越多，光谱特性越差，谱线干扰也大。 2.原子化器 原子化器的功能是将试样转化为所需的基态原子。被测元素由试样溶液中转入气相，并解离为基态原子的过程，称为原子化过程。实现原子化的方法有两种:火焰原子化法和无火焰原子化法。 (1)火焰原子化法实现火焰原子化的原子化器有两种，即全消耗型和预混合型。全消耗型原子化器系将试液直接喷人火焰;预混合型原子化器泡括雾化器、雾化室和燃烧器三部分，雾化器将试液雾化并使雾滴均匀化，然后冉喷人火焰中。一般仪器多采用预混合型。

雾化器的作用是使试液雾化。目前普遍采用同心形雾化器，目前普遍采用同心型雾化器，多用特种不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成，其中的毛细管多用贵金属的合金制成，能耐腐蚀。当高压载气(助燃气)以高速通过时，在毛细管外壁与喷嘴口构成的环形间隙中形成负压区，从而将试液沿毛细管吸入，并被高速气流分散成雾滴，经节流管碰在撞击球上，进一步被分散成细雾。末被细微化的雾滴在雾化室内凝结为液珠，沿排泄管排出;细雾则在室内与燃气充分混合并进入燃烧器。燃烧器的功用是形成火焰，使进入火焰的微粒原子化，常用的燃烧器是单缝型喷灯，缝长有5cm和10cm两种。预混合型原子化器的优点是，进人火焰的微粒均匀且细微，在火焰中可瞬吋原子化，形成的火焰稳定性好，有效吸收光程长;缺点是试样利用效率较低，一般约为10%，试液浓度高时，试样在雾化室壁宥沉积，产生“记忆”效应。试样雾滴在火焰中，经蒸发、干燥、离解(还原)等过程产生大量基态原子。火焰燃烧的速度影响火焰稳定性和操作安全，而火焰温度会影响化合物的蒸发和分解。火焰温度越高，产生的热激发态原子越多，但同时也可能会产生干扰。因此，在保证待测元素充分离解为基态原子的前提下，尽量采用低温火焰。火焰温度取决于燃气与助燃气类型，根据燃气与助燃气的比例可分为三种类型: ①化学计量火焰(中性火焰），温度高，干扰少，火焰稳定，背景低，实验中常用; ②贫燃火焰(氧化性火焰），助燃气多，火焰温度低，氧化性气M，适用于碱金属测定; ③复燃火焰(还原性火焰），燃气多，燃烧不完全，适合测定较易形成难熔氧化物的元素(Mo、Cr、稀土等)的测定。空气-乙炔火焰较为常用，最高温度为2600K，能测35种元素。乙炔-氧化亚氮火焰也较为常用。不同火焰的温度如表所示。

(2)无火焰原子化法在无火焰原子化法中，有石墨炉法、冷蒸气发生原子化法及氢化物发生原子化法等。应用广泛的原子化器是管式石墨炉原子化器。本质上它是一个电加热器，由电热石墨炉及电源等部件组成。其功能是利用电能加热盛放试样的石墨容器，使之达到高温，将供试品溶液干燥、灰化，再通过高温原子化阶段使待测元素形成基态原子。石墨炉是外径为6mm、内径为4mm、长度为53mm的石墨管，管两端用铜电极夹住。样品用微量注射器直接由进样孔注入石墨管中，通过铜电极向石墨管供电。石墨管作为电阻发热休，通电后可达到2000~3000°C高温，以蒸发试样和使试样原子化。铜电极周围用水箱冷却。盖板盖上后，构成保护室，室内通以惰性气休氩气或氮气，以保护原子化了的原子不再被氧化，同时也可延长石墨管的使用寿命。原子化过程分为干燥、灰化(去除基休)、原子化、净化(去除残渣）四个阶段，待测元素在高温下生成基态原子。与火焰原子化法相比，石墨炉原子化的特点是，原子化在充有惰性保护气的气室内，有利于还原性石墨介质中进行，有利于难熔氧化物的分解;取样量小，通常同休样品为0.1~10mg，液休样品为1~50μl，试样全部蒸发，原子在测定区的有效停留时间长，几乎全部样品参与光吸收，绝对灵敏度高;排除了化学火焰中常常产生的被测组分与火焰组分之间的相互作用，减小了化学干扰;固体试样与液休试样均可直接应用。由于取样量小，试样组成的不均匀性影响较大，测定精度不如火焰原子化法好;有强的背景;设备比较复杂，费用较高。氢化物发生原子化器由氢化物发生器和原子吸收池组成，可用于砷、硒、锡、锑等元素的测定，其功能是将待测元素在酸性介质中还原成低沸点、易受热分解的氢化物，再由载气导入由石英管、加热器等组成的原子吸收池，在吸收池中氢化物被加热分解，并形成基态原子。冷蒸气发生原子化器由萊蒸气发生器和原子吸收池组成，专门用于汞的测定。其功能是将供试品溶液中的汞离子还原成汞蒸气，再由载气导入石英原子吸收池进行测定。非火焰原子化法的优点是灵敏度高，取样量少，甚至可不经过前处理直接进行分析。但基体的影响比火焰法大，测定的精密度(5%?10% )比火焰法(1% )差。 3.单色器 单色器的作用是将所需的共振吸收线分离出来，由于原子吸收分光光度计采用锐线光源，吸收值测量采用瓦尔什提出的峰值吸收系数测定方法，吸收光谱本身也比较简单，因此对单色器分辨率的要求不是很高。单色器中的关键部件是色散元件，现多用光栅。为了阻止来自原子吸收池的所有辐射不加选择地都进入检测器，单色器通常配置在原子化器以后的光路中。 4.检测系统 检测系统主要由检测器、放大器、对数变换器、指示仪表所组成。检测器多为光电倍增管和稳定度达0.01%的负高压电源组成，工作波段大多在190~900nm之间。

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原子吸收分光光度计原子吸收分光光度计的基本构成及部件_原子吸收分光光度计

　　分光光度计的使用步骤主要有哪些?下面本生(天津)健康科技有限公司工程师做如下绍：

　　一、把分光光度计电源线连接好，仪器的电源具备接地功能;

　　二、接通电源后，按动开机开关，然后让仪器预热至少20分钟，仪器会自动校正，然后显示546.0nm 0.000A说明自检结束，就可以开始测试;

　　三、使用“方式”键测试的方式，再根据自己要测量的结果选透光率、吸光度、和浓度的测试;

　　四、要对波长进行分析，选择按键6，然后按提示依次进行;

　　五、把样品溶液和要测定的溶液各自倒入比色皿中后，然后打开样品盖，把盛着溶液的比色皿插入另一个比色皿中，后盖好样品盖;

　　六、把参比的溶液拉到光路中按住“OABS/100%T”键，这时的显示器会显示出BLANKING,，直到后显示出“100%T”或者是“0.000A”为止;

　　七、后仪器显示出“100%T”或者是“0.000A”即可结束测试。这时被测样品的透光度、吸光度等参数就可直接读出;

　　八、分光光度计使用完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

　　分光光度计的使用注意事项：