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液相色谱法测定石杉碱甲的含量液相色谱如何操作

时间：2020-08-06 来源：仪多多仪器网作者：仪多多商城

昆明石杉HuperziakunmingensisChing.系石杉科石杉属植物，为我国特有种，主要分布于云南、贵州等地，生于灌木下、苔藓丛中。20世纪80年代，我国科学工作者从同属植物蛇足石杉中分离到石杉碱甲(Hup-A)，并阐明它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗重症肌无力、记忆力减退和早老年痴呆具有较好的效果，现已被广泛应用于临床。为了科学、合理地利用石杉属植物资源，本实验首次采用HPLC法对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定

1、仪器与试药

Aigent1100型HPLC色谱仪(带四元泵，自动进样器，紫外检测器等);电子分析天平(日本岛津);KQ50B超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(上海医疗器械厂);石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401);乙腈(色谱纯);二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。

实验药材采至贵州黔东南，由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉H.kunmingensisChing.，标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所，标本凭证(20056)。

2、方法与结果

2.1色谱条件ZORBAXSB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)，检测波长为310nm，流速1ml·min-1，柱温25℃，进样量为5μl。在此色谱条件下，样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离，其理论塔板数为4656，对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15min，对照品与样品的色谱图见图1。

2.2样品的制备

精密称取实验药材细粉2g于500ml的圆底烧瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次，合并滤液并回收溶剂，加入2%的酒石酸溶解，用氨水调节pH值至8.0，再用氯仿萃取至Dragendorffors反应呈阴性，挥干有机溶剂，用无水乙醇溶解并定容至25ml即得。

2.3线性关系的考察

精密称取石杉碱甲对照品2.40mg于25ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容，得浓度为0.096mg·ml-1对照品溶液，再分别稀释成0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的对照品供试液，在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回归，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995。可知石杉碱甲在0.015～0.48μg之间与峰面积呈良好线性关系。

2.4精密度实验取石杉碱甲对照溶液，在色谱条件下重复进样6次，结果石杉碱甲峰面积的RSD为0.36%(n=6)。

2.5稳定性实验取供试品溶液，每隔2h测定1次，考察石杉碱甲的含量变化，结果含量的RSD为0.85%(n=6)，表明供试品在10h内稳定。

2.6重复性实验精密称样品6份，按“2.2”项的要求制备6份供试液，在色谱条件下分别进行测定，结果Hup-A含量的RSD为0.60%(n=6)。

2.7回收率实验精密称取昆明石杉药材细粉6份，每份1g，分别加入对照品供试液(0.003mg·ml-1)100ml，按样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试液进行测定，计算回收率(见表1)。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉碱甲加样回收率实验结果(略)

2.8样品的测定

按“2.2”项的要求精密称取样品3份，制备供试液，按色谱条件进行测定，重复3次，取平均值，石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。

3、讨论

首次采用HPLC法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。

测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定方法的基础上，改用ZORBAXSB-C18色谱柱及以0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)为流动相。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。

第1期 | 色谱柱使用一段时间后出现肩峰，怎么处理？

在流出曲线或吸收曲线的峰上出现的不成峰形的小曲折(deflection)，形状类似肩膀，故称为肩峰，这是对于曲线形状的一种描述。

Question：

色谱柱使用一段时间后出现肩峰，怎么处理？

Lubex：

多种原因可导致出现肩峰，可从以下方面考虑。

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检查色谱柱是否虚接，虚接后会造成锋均展宽且拖尾等现象。

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个别峰出现肩峰，考虑是否色谱条件不合适导致，调节流动相增大保留能力，提高分离度。反相的话基本上是减小一下流动相中有机相比例，正相的话就要增大流动相中弱极性成分的比例了。

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谱图中所有峰均出现肩峰，考虑污染导致。可加大洗脱强度冲洗色谱柱，对于反相柱：甲醇-乙腈-异丙醇-甲醇冲洗；另外考虑到柱头污染，还可反冲，需注意应断开检测器小流速冲起。

时间久的关系会影响色谱峰的峰型和状态。

选购优良液相色谱仪应该考虑的地方

　　选购一台品质优良的液相色谱仪应从以下几个方面考虑：

　　首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多，有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要技术指标，根据国家标准，仪器的主要指标有噪音，漂移，最小检测浓度，定性定量重复性等。这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。就是需要把各单元装置都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的，而不是单单用个检测器或是泵的。

　　然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。

　　1.噪音

　　是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。

　　2.漂移

　　是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高了分析效率。

　　3.定性定量重复性

　　主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。

　　4.最小检测浓度(最小检测限)

　　最小检测限是反映仪器灵敏度的重要参数。CL=2NdC/H(CL ：最小检测浓度 Nd:噪音 C：样品浓度最小检测浓度 H：样品峰高)由上式可见，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音。

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