Agilent液相色谱仪标准操作程序
1.目的：建立一个液相色谱的标准操作程序。
2.范围：适用于Agilent液相的使用。
3.责任：使用Agilent液相的化验员。
4.程序
4.1工作环境
实验室温度为20～27℃，温度变化<3℃/hr，相对湿度<80%，液相色谱仪工作台，长2米、宽0.8米、承重大于80公斤，离墙距离0.3米以上。单相交流220V，（+5%～10%），50～60Hz，有单独的良好接地。配置稳压电源，功率大于2.5千瓦。
4.2使用前的准备
4.2.1二次蒸馏水，（建议用0.45微米水相滤膜过滤）；甲醇或乙晴（色谱纯），（建议用0.45微米有机相滤膜过滤）；其他样品所需流动相，（都需经过0.45微米滤膜过滤）。将上述溶剂放入超声波池，除去气泡，方可使用。
4.2.2把流动相放入溶剂瓶中，打开purge阀，单击pump图标，出现参数设定菜单，单击setup选项，进入pump编辑画面，设flow：5ml/min，单击OK；单击pump图标，出现参数设定菜单，单击pump control选项，选中ON，单击OK，则系统开始purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续purge，直到所有要用通道无气泡为止；单击pump图标，出现参数设定菜单，单击setup选项，进入pump编辑画面，设flow：1.0ml/min，关闭purge valve。单击pump下的的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积，也可输入阻止分析和关泵的体积，单击OK。
4.2.3进行样品前处理（稀释或溶解至所需浓度）。
4.3实验步骤
4.3.1准备
4.3.1.1开启Agilent 1100LC各模块电源。
4.3.1.2打开计算机，双击online图标。
4.3.1.3从"view"菜单中选择"method and run control"画面，单击"view"菜单中的"show top toolbar","show status toolbar","system diagram","sampling diagram"使其命令前有"√"标志。
4.3.2数据采集方法编辑
4.3.2.1从“method"菜单中选择"edit entire method"项，选中除"data analysis"外的三项，单击OK，进入下一画面。
4.3.2.2在"method comments"中加入方法的信息（如This is for test!），单击OK进入下一画面。
4.3.2.3泵参数设定
在"flow"处输入流量1ml/min，在"solvent"处输入流动相中各溶剂所占的比例，也可"insert"一行"timetable",编辑梯度。在"pressure limits max"处输入柱子的zui大耐高压，以保护柱子，单击OK进入下一画面。
4.3.2.4柱温箱参数设定
在"temperature"下面的方框内输入所需的温度，并选中它点击"more>>"键，如图所示，选中"same as left"使柱温箱的温度左右一致，点击OK进入下一画面。
4.3.2.5 VWD检测器参数设定
在"wavelength"下方的空白处输入所需的检测波长，在"peak width(response time)"下方点击下拉式三角框，选择合适的响应时间，如>0.1min 。 在"timetable"中可以"insert"一行，可以输入随时间切换的波长。
4.3.2.6在"run time checklist"中，选中"data acquisition"，单击OK。
4.3.2.7单击“method"菜单，选中"save method as"，输入一方法名，单击OK。
4.3.2.8从"run control"菜单中选择"sample info"选项，输入操作者姓名，在"data file"中选择"manual"或"prefix"。
4.3.2.9从"instrument"菜单中，选择"system on"。
4.3.2.10单击OK，等仪器ready，基线平稳，从"method"菜单中选择"run method"，进样。
4.3.2.11进样时，阀门位置处于"inject"位置，进样针取样量应为所规定体积的三倍，用滤纸拭净针头表面残留液，进样时要轻而快，进样完毕应快速将阀门搬至"load"位置，进样完毕，数分钟后将进样针拔下，阀门回复到"inject"位置。 4.3.3数据分析方法编辑
4.3.3.1从"view"菜单中，单击"data analysis"进入数据分析画面。
4.3.3.2从"file"菜单中选择"load signal"选项，选中您的数据文件，单击OK。
4.3.3.3做谱图优化，从"graphics"菜单中选择"signal options"选项，从"ranges"中选择"auto scale"及合适的显示时间，单击OK，或选择"use ranges"调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4.3.3.4积分
4.3.3.4.1从"integration"中选择"auto integrate"，如积分结果不理想，再从菜单中选择"integration events"选项，选择合适的"slope sensitivity","peak width","area reject","height reject"。
4.3.3.4.2从"integration"菜单中选择"integrate"选项，则数据被积分。
4.3.3.4.3如积分结果不理想，则重复上两步动作，直到满意为止。
4.3.3.4.4单击左边"√"图标，将积分参数存入方法。
4.3.3.5打印报告
4.3.3.5.1从"report"菜单中选择"specify report"选项，进入。
4.3.3.5.2单击"quantitative results"框中"calculate"右侧的黑三角，选择所需的报告形式，其他选项不变，单击OK。
4.3.3.5.3从"report"菜单中选择"print report"，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击"report"底部的"print"钮。
4.3.4关机
4.3.4.1关机前，先用水和有机溶剂对系统进行梯度冲洗，然后再用有机溶剂冲洗系统，然后关泵（适用于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
4.3.4.2退出化学工作站，及其他窗口。
4.3.4.3关掉Agilent1100电源开关，计算机（用shut down关）。
4.4.1色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死。
4.4.2对于手动进样器，当使用缓冲液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次。
4.4.3流动相使用前必须过滤、超声，不能使用多日存放的纯化水（易长菌），应每天更换纯化水。
一、液相色谱仪峰分叉怎么回事?
造成这种情况的原因一般是色谱柱被污染，或柱头填料塌陷导致的。
对于*种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，zui后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。
对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。
二、如何排除液相色谱仪气泡溢出的故障?
流动相内产生都无法清除不断产生的气泡，主要是因为过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开泄压阀，打开purge键清洗脱气，如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器中冒出，说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏，流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀，打开泵，流速调至1.0～3.0ml/min，纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。
三、自检时，为什么有时会出现“钨灯能量低”的错误?
一般来说，原因是系统中有挡光物，光路偏离，钨灯电源系统或钨灯灯泡已坏。这时首先要检查光度室是否有挡光物;打开检测器光源室盖，检查氘灯是否点亮;如果氘灯不亮，则关机，更换新氘灯，换时，需注意型号;检查氘灯保险丝，看是否松动、氧化、烧断;如果故障，应立即更换;再开机重新自检;若仍出现上述故障，则重新安装软件后再进行自检。
四、出现压力波动大，流量不稳定该怎么办?
造成这种情况的原因是系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。
五、液相色谱仪峰面积重复性不好怎么回事?
主要原因可能有进样阀漏液、加样针不到位或液量不足。针对*种情况，处理时应对更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要，如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中，储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命，同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记，用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
六、液相色谱仪液相色谱柱压升高的原因是什么?
造成柱压升高的原因很多。一般是由于柱床内产生了异常的占位性物体，造成流体阻力加大所引起的。例如，缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内，或样品污染沉积。针对*种情况，处理时应先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，zui后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
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