液相色谱事务汇总集 液相色谱如何操作

液相色谱关于多数人来说都是很好上手的仪器了，但是就算是用过几年、经历丰厚的剖析员都会习气于一些错误的操作，经常招致一些仪器毛病。便当快捷的剖析过程固然重要，但是为了多做样品而疏忽了一些必不可少的步骤，常常得失相当，哪些操作不能做？哪些懒儿不能偷？那些小概率的毛病师傅没教怎样办？液相运用过程中有哪四大关键要素要留意？

活动相不过滤

由于尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因而应预先除去活动相中的任何固体微粒。活动相可以在玻璃容器内蒸馏，而常用的办法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2μm或0.45μm）等滤器。泵的入口都应衔接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或改换。

运用后没有及时清洗泵

活动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的活动相不应保存在泵内，特别是在停泵过夜或更长时间的状况下。假如将含缓冲液的活动相留在泵内，由于蒸发或走漏，以至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。

因而，必需泵入纯水将泵充沛清洗后，再换成合适于色谱柱保管和有利于泵维护的溶剂（关于反相键合硅胶固定相，能够是甲醇或甲醇-水）。

活动相走空

泵工作时要留心避免溶剂瓶内的活动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。

没有活动相流出，又无压力指示怎样办？

可能是泵内有大量气体，这时可翻开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处协助抽出气体。另一个可能缘由是密封环磨损，需改换。

压力和流量不稳了？

缘由可能是气泡，需求扫除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物局部梗塞，这时，可卸下砂滤棒浸入活动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内疾速除去微生物，或将盐溶解，再立刻清洗。

压力为啥过高或过低？

可能是是管路被梗塞，需求肃清和清洗。压力降低的缘由则可能是管路有走漏。检查梗塞或走漏时应逐段停止。

在停止梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不时变化，因而带来一些特殊问题，必需充沛注重：

PS：（在液相色谱中对组分复杂的样品采用梯度洗脱的办法。在同一个剖析周期中，按一定程序不时改动活动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而能够使一个复杂样品中的性质差别较大的组分能按各自适合的容量因子k到达良好的别离目的。

梯度洗脱的优点：1.缩短剖析周期；2.进步别离才能；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加灵活度。但有时惹起基线漂移。）

梯度洗脱的活动相选择不当

要留意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的活动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，运用时更要惹起留意。

当有机溶剂弛缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，特别运用磷酸盐时需特别当心。

疏忽的空白梯度洗脱

梯度洗脱所用的溶剂纯度请求更高，以保证良好的重现性。停止样品剖析前必需停止空白梯度洗脱，以识别溶剂杂质峰，由于弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。

用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以避免混合时产生气泡。

疏忽了溶剂混合所带来的粘度变化

混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱经常呈现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为活动相时的两倍。因而要留意避免梯度洗脱过程中压力超越输液泵或色谱柱能接受的最大压力。

关于六通阀的正确运用和维护

①样品溶液进样前必需用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。

②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则活动相受阻，使泵内压力剧增，以至超越泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。

③为避免缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次剖析完毕后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

关于色谱柱的运用和维护

色谱柱的正确运用和维护非常重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短运用寿命以至损坏。在色谱操作过程中，需求留意下列问题，以维护色谱柱。

调理流速太快。。。

防止压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的忽然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充情况；柱压的忽然升高或降低也会激动柱内填料，因而在调理流速时应该迟缓停止，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。

反冲色谱柱。。。

普通说来色谱柱不能反冲，只要消费者指明该柱能够反冲时，才能够反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会疾速降低柱效。

预柱和维护柱

选择运用适合的活动相（特别是pH），以防止固定相被毁坏。有时能够在进样器前面衔接一预柱，剖析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使活动相在进入剖析柱之前预先被硅胶“饱和”，防止剖析柱中的硅胶基质被溶解。

防止将基质复杂的样品特别是生物样品直接注入柱内，需求对样品停止预处置或者在进样器和色谱柱之间衔接一维护柱。维护柱普通是填有类似固定相的短柱。维护柱能够而且应该经常改换。

液相色谱在运用过程中主要有四大关键要素

1.液相色谱仪自身：

关于仪器自身普通不会有问题，特别是刚买回来的新仪器。关于仪器自身较为重要的就是仪器的校验，刚买回来的仪器普通都是由卖家先对仪器做系统确实认工作（包括IQ、PQ、OQ），确认顺利经过后，再请国度或省级仪器检定局的来校验，检定合格后就能够放心运用了，除此之外，一些做得好的公司每半年会对仪器停止一次的内部校验，目的就是为了保证仪器的正常可运转状态。

2.色谱条件：

色谱条件普通包括活动相、色谱柱、检测波长、流速及进样量。

活动相就触及到配制活动相所用到的水和试剂试液，水普通请求用超纯水或其他水的电阻率不大于18.2兆欧级别，试剂试液请求用色谱级别的，缘由为避免水和试剂试液中的杂质对色谱结果的干扰。

色谱柱会因不同的种类而有不同的请求，但每根色谱柱都有它的清洗请求，这个在色谱柱阐明书上都能够找到，一定要依据上面的请求停止，否则会形成色谱柱效降落和色谱柱的运用寿命缩短，检测波长也会因种类的不同有不同的请求，这里需求指出的是要留意察看检测器氘灯能量的变化，比方基线动摇大，活性成分的响应值忽然变小等，都有可能是氘灯的能量缺乏所惹起的，氘灯普通倡议运用800小时，但实践上运用时间不止，可依据实践状况改换。

流速也因种类的不同而不同，普通为1.0ml/min，流速是不可随意改动的，特别是作为QC人员，但是作为研发人员，有时为了探索条件或停止办法耐用性考证，会对流速停止改动以评价办法的适用性。关于进样量因不同的种类也有不同规则，进样量这块如今都运用自动进样，所以进样精细度都很好，不需强调什么。

3.操作人员：

首先，作为液相操作人员，一定要认真学习夜想的阐明书，控制液相硬件和软件的操作，控制日常的维护颐养，控制最根底毛病的扫除和维修。

普通液相的操作规程也是有操作人员起草的，所以只需严厉依照操作请求停止操作，普通不会呈现问题，当然啫喱需求特别指出的是关于液相的日常维护颐养很重要，比方活动相的过滤、脱气、泵密封垫的清洗、系统管路的清洗、溶剂过滤头的清洗等，假使不坚持，很容易招致色谱柱梗塞、系统压力过大、色谱峰异常等不用要的毛病，糜费时间。

其次，操作人员在配制液相剖析用样品溶液时，可以由同一个人单独完成，以免不用要的偶尔误差。

4.液相装置环境：

液相色谱仪应尽量装置于程度、远离振动、电磁干扰的屋内的台面上，有条件的话尽量将液相数据处置系统分隔开，一个是避免色谱基线噪音偏大，基线不稳等，一个是为减少对人体的危害。

各位小伙伴在实验分析中应该都遇到过这类问题，在液相色谱中，对于组分复杂的样品，采用一种色谱体系，往往很难得到理想的分离效果，要么分离时间太长，要么分离度太差。这种情况，采用梯度洗脱就可以缩短分析时间，提高分离效果。下面和大家分享一则梯度微调实例，一起感受下梯度微调对分离效果的奇妙影响吧。

1、尽量在能长时间测试该项目的仪器上开发方法；

2、需要了解系统的性能，避免出现仪器系统改变后不能重现的问题；

3、要知道系统的两个基本情况：梯度滞后体积和比例精确性。这可以在同一个实验里得到这两个数据：参考《JJG 705 2014液相色谱仪检定规程》中《梯度误差》实验：在B溶液（0.1%丙酮）后加紫外检测器，设置一个多阶层的梯度，B溶液以5%的幅度从0%变到100%，流速与平常一样，流速为1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通运行梯度，记录图谱。每段梯度设置的时间与实际发生的梯度时间之差就是梯度延迟时间，阶层的高度可以用来测量流动相比例，这些阶层可能有点模糊，是由系统中混合体积造成的；

4、检测完系统，就可以按照它的性能来设计方法。梯度方法转换最大的问题是梯度滞后体积，如果知道仪器的滞后体积比最初开发方法的仪器大，就要自觉的在方法前加一段等度来抵消这一差别，如果目标系统滞后体积小，就要在转移方法的时候在方法开始加一段梯度延迟时间，如果比例差别是在梯度运行中间出现的，也可以通过调节梯度图谱来抵消这种差别，但是一般很少遇到过需要这么做的情况。

5、初始流动相没有充分平衡。柱子已经用初始流动相平衡了，但在分析中，梯度变化很快，而柱子没有用初始流动相充分平衡好，这样di一针时总是与后面的不一样。但是如果转移到有不一样滞后体积的系统时，可能就是另一种情况。

项目背景

名称：12种酚类

色谱柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流动相A：水   流动相B：乙腈

问题：柱子正常活化进样，基线和整体出峰均不理想，分离度较差。

1.柱子在运输或储存过程中保存液发生变化，导致填料产生微小改变，碳链蜷缩，未舒展开来，对目标物的保留造成影响；

2.仪器系统存在梯度滞后，在梯度变化过程中，两相混合不精准，导致的物质分离问题；

3.目标物受溶剂效应影响；

4.梯度变化过快，流动相的洗脱能力太强，导致色谱峰未达到分离效果。

1.测试梯度滞后体积和比例精确性；

2.用初始流动相0.2流速过夜平衡柱子；

3.样品用初始流动相溶解（慎用，改变样品溶剂后需要验证样品溶液的稳定性）；

4.调节梯度，减缓洗脱速率，减小洗脱能力；

基线和峰形大有改善，但是最后一个峰在梯度时间外出峰了。

梯度变化中，水相速率增长较快，物质保留变强，没有获得足够的洗脱能力，最后一个物质出峰较晚。

前段分离好的梯度不做调整，调整最后一个物质出峰梯度阶段的有机相比例，增加洗脱能力。

以上说明，项目的成功与否，不仅取决于色谱柱类型，仪器条件，还有方法的建立。其中流动相便是考察重点，流动相梯度洗脱必要时可以充分应用上，他是由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中不同时间段各溶剂组成的比例改变流动相极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品的所有组分在最短时间内实现佳分离。好啦，今天的分享就先到这，希望能对小伙伴们有所启发有所帮助哦。