液相色谱法是分析化学中发展较快、应用广泛的一种分析方法，特别是高效液相色谱仪已经成为生命科学、材料科学、环境科学等方面必不可少的重要检测方法。现代科学技术的发展使得分析对象越来越复杂，分析要求越来越高，液相色谱的强大功能使其成为新世纪中解决生命科学、材料科学、环境科学等复杂体系发现难题的比较有力的技术和方法。
高效液相色谱仪是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定的亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关，一般情况下，高效液相色谱仪的分析可在室温下进行，由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相黏度高，因此必须采用高入口压，以此来维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的物质特别有利，它在医药、生化等方面具有非常重要的作用。
色谱柱的常见问题：
1.色谱柱污染：
目前,基层实验室多采用反相色谱柱,要减少色谱柱的污染比较有效的办法是要纯化样品。凡是样品纯化得越干净,色谱柱的寿命就越长;反之,只有提取没有纯化的样品,色谱柱柱效就会大幅下降。一般来说,要提取纯化好的样品,可以的方法是用流动相溶解样品,这样,一方面能减少色谱图中的溶剂峰干扰,另一方面也能检查样品在流动相中的溶解性。如果样品进样后在流动相中沉淀,会堵塞进样器和柱头,甚至样品分解,出现鬼峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件,可更换样品溶剂,或改进样品纯化处理的方法,或滤过去除不溶性物质。
2.色谱柱阻塞与对策
如果配有保护柱,应先去掉保护柱进行分析。如果色谱柱阻塞,可进行反冲洗。如果问题仍然存在,色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,可能是进口阻塞,更换入口处的筛板或更换色谱柱。如果必要,亦可更换色谱柱。
3.严格清场
清洗的过程是延长色谱柱寿命的关键,每次分析工作结束时,要做好清场工作。如果流动相是缓冲盐,先用5%甲醇水冲洗30 min以上；如果流动相是离子对,先用50%甲醇水冲洗30 min以上；如果流动相是酸性溶剂,先用纯水冲洗30 min以上,流速0.5 mL#min-1,最后过度到用色谱甲醇冲洗色谱柱,目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇-水为流动相也应这样冲洗色谱柱,在一定程度上可恢复柱效。
使用液相色谱仪的小伙伴肯定会遇到漏气和漏液的状况，流动相是造成液相色谱各种问题的主要源头。液相色谱常见的故障一是堵，二是漏。今天就这两部分别展开讨论(流动相以甲醇为例，色谱柱以C18为例) 。
惠州市华高仪器设备有限公司
查堵
首先，为何会堵？“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。
液相色谱仪
1、纯水中的细菌污染
首先我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，’华高仪器设备‘直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。
解决办法：
(1)理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。
(2)成箱购买市售品牌纯净水，如500ml的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一瓶做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一瓶即可，也很方便。每次成本2元左右。这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到后一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的
实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。
水有保证，可以不过滤？
(1)流动相过滤在理论上有好处，但是实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。
(2)流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。主要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本上升。
2、流动相的细菌污染
流动相刚开始不长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。举简单的例子：50%的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好实验效果。
但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌(很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是肥料，细菌长得更迅速)，一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。
所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相。从实际实验效果来说，我建议用10%的甲醇水代替水溶液(以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以完全杀菌了)，这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。
3、不适当操作
(1)在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。
(2)样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形阻塞不畅。
(3)在使用用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成死堵，压力快速升高超过警戒值。
(4)在使用金属管路作出废液管时，应当注意废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。
4、查堵的方法
在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件(柱子除外)装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。
查漏
“漏” 分两种：漏液和漏气。漏液，液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生漏液，那就是故障所在。漏液的原因分两种：
1、接触硬件不当
在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选项用PEEK接头是一较好是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松;
另一种不当就是致命的错误：滑丝，这往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。
2、使用仪器不当
只要互相有10%比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲液盐溶液(不论甲醇含量有多少)作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。
漏气，漏液是从内部向外漏，而漏气则是外部了的气体进入液相色谱仪的流路内部形成气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。
（1）过滤头
做油液时，在流路管中有不规则但持续的小气泡产生，这时考虑的是流动相有没有脱气(需要特别提醒即使是有了真空脱气机也是要先超声脱气的，起码可以减少脱气机的工作压力并提高工作效率)，如果已脱气，则要注意过滤头的污染也会造成这种现象。处理方法比较简单，拧下过滤头在稀硝酸中浸泡，超声半小时，洗净后装回去即可。
（2）透明流路管
指的是在过滤头和输送泵之间的那一段管路。这一个部分往往不是有点气泡，而经常是整个管中全是空气而操作人员却浑然不知，以致输送泵工作了半天才发现流动相瓶里的液体一点也没少。这也是我们常说的液相色谱仪至少一周要开机一次的原因(我们做液相一定要有“微渗”的概论)。如果长时间不用，这一段管路的液体会彻底干掉，而充满空气的管路和充满液体的管路不仔细看是分辨不出来的。这种情况对于输送泵很危险，因为泵从设计来说是输送液体而不是输送气体，内部的液体对于活塞来说起到了机油的作用，如果活塞杆还残存了一些缓冲盐，则极易拉伤，造成不可逆转的影响。
对于这种情况，要突出“预防为主”如：液相色谱使用人员要相对固定和稳定，工作中合理搭配资源，每台机一周至少一次实验，如长期不用起码每周要冲流动相2小时。养成良好的工作习惯很重要。
如果流路管中真漏气了怎么办？
我的建议是用外力使管路中充满液体。
具体如下：
1、找到流路管进入输送泵的接头。
2、拧下来。
3、用一干净洗耳球的对准管路的平整切口。
4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。
5、快速把接头拧回输送泵上(这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象)。
6、开机，打开排液阀门，启动输送泵。
7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。
（3）输送泵和柱子
这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。
（4）检测器
应该说，整个流路中只要有一个气泡都会在检测器上得到强烈的信号反映，检测器内部的气泡一般都能被冲走，但也有很难冲掉的残留气泡的情况。如果检测器内有残留气泡，会有特别明显的表现形式，就是在走基线时会时不时间隔出现直上直下信号很大的信号峰。这时先看普通流量能否冲走，如果冲不走，办法就是拆柱，把检测器直接连接到输送泵的出口，加大几部流量冲洗，则肯定能冲走气泡。
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