荧光显微镜是怎样工作的 显微镜是如何工作的

荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。
　　
　　由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。
　　
　　荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源、滤片系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成(图3-12)，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
　　
　　激发荧光的方式：按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。
　　
　　BV激发法是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。用于荧光抗体法的荧光色素。对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较高，可得到较明亮的图像。其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。
　　
　　综上所述，荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑。
　　
　　①从荧光像的反差要求来看，UV激发暗场聚光器照明可以。
　　
　　②以像的亮度来考虑，BV激发滤光片暗场观察效率最高。
　　
　　③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性，可看作介于这两种照明方法之间，但前者滤光片暗场的性质较强，显示图像较明亮，反差小；后者因保留暗场光路的性质，故显示图像较暗，而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采用比较适合标本要求的照明法进行观察。
　　
　　必须指出，即使像反差较佳的UV激发暗场聚光器照明，由标本折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，这样在光学系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因此，必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为截止滤光片。

显微镜包括两大部分，分别是显微镜的机械装置和显微镜的光学系统，下面具体介绍这两个部分
（一）显微镜的机械部分

1．镜筒  为显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装目镜，下端与物镜转换器相连。作用是保护成像的光路与亮度。

2．转换器　固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜。

3．粗准焦螺旋　位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距。

4．细准焦螺旋　位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距。

5．镜座　是位于镜臂的下方，显微镜的底部，呈马蹄形的金属座。用以稳固和支持镜身。

6．镜柱　从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。

7．倾斜关节　镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°）便于观察。但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体。

8．载物台　从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片。较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移动。

（二）显微镜光学部分

1．目镜　它是安装在镜筒上端的镜头。是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如 5×、10×、15×、20×。

2．物镜　是决定显微镜质量的关键部件。安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。一般有三个放大倍数不同的物镜，即：低倍物镜（8×或10×）、高倍物镜（40×或45×）和油浸物镜（90×或100×），根据需要可选择一个使用。显微镜的放大倍数是目镜倍数乘以物镜的倍数。

3．反光镜　在聚光器的下面有一个一面平另一面凹的双面圆镜。可作各种方向的翻转，光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜。

4．聚光器　（学生用显微镜一般没有这个装置）是由凹透镜组成的，它可以集中反光镜投射来的光线。在镜柱前面有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强。

5．虹彩光圈　又称可变光阑，由多数金属片组成（学生用显微镜一般没有这个装置），在较高级的显微镜上具有此装置。使用时移动其把柄，可控制聚光器 透镜的通光范围，用以调节光的强度。虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调。

6．遮光器　简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而装有遮光器。遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）。光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱。

显微镜的成像原理（放大原理）

光线→反光镜→遮光器→通光孔→标本（一定要透明）→物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）→镜筒→目镜（再放大成虚像）→眼。