高效液相色谱仪的使用
1．色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净，用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中，用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液，用正己烷（含0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）为流动相测定柱效及分离度塔板数在2～3万/ml以上及分离度在1.5以上者，柱效好。为防止柱污染，常用1个50mm长，4~5mm内径，装有硅胶（40-50mm）或立柱相同填料的保护柱（预柱）接在主柱之前，以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经，以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚，再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。
2．流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中，经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱，最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法（isocratic dlution），即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法（gradicnt clution）,即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比，从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离，而整个色谱过程缩短。必须注意，梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。
3．检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收，荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物，大多数药物分子对紫外光有吸收，故能较普遍采用，检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器，既能使流动相停流作组分的定性定量检测，又能提高测定灵敏度，重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源，光强度增加了3~4倍，对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测儿茶酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池，在一暄电压下电解产生电流，放大后检测，检测限pg级。
4．数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统，除记录谱外，还能自动记录峰的保留时间，能自动积分求算峰面积，并能按照预定的程序作有关计算，报告分析结果。
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法
1 液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成（如图1所示）。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是容易出事故的主要场所。
2 常见问题及解决方法
2．1 针对柱压问题（表1）
柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50PSI之间。压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。值得注意的是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。首先考虑柱子是否被堵，此时可更换一根新柱子进行检测。
2．2 针对保留时间漂移的问题 [2，3] （表2）
保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，其包括了保留时间增大和减小。它的产生与很多原因有关。
2．3 针对异常色谱峰问题[2-4]
异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。具体情况与原因分析如表3。
3 高效液相色谱仪的保养[5-7]
3．1 HPLC的日常操作条件
工作温度10～30℃； 相对湿度<80％； 可以是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。
3．2 泵的保养
使用流动相尽量要清洁；进液处的沙芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡。
3．3 进样器的保养
每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。
3．4 柱的保养
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪连接时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。
3．5 检测器(UV)的保养
紫外灯的保养要在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。同时样品池要保养。
4 结语
在高效液相色谱使用过程中故障排出时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，从而确定假定因素与问题之间的联系；如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，从而避免浪费；养成良好的记录习惯，一个良好的记录是成功地进行故障排除的关键。
总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养，仪器系统的干净是用好仪器和维护维修仪器的关键。
液相色谱柱的使用维护
一、液相色谱柱的基本结构。
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。
压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
二、色谱柱使用前注意事项。
色谱柱在使用前，hao进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是jia条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、hao使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm或0.22µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，hao使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求jia柱效，hao使用jia流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用jia流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流动相hao在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。hao加入die氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45 μm或0.22µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三、 色谱柱的使用及维护
1、C18等反相色谱柱使用维护
色谱柱每次使用时一定不要直接使用含无机盐的流动相！
A、建议首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含盐）冲洗系统及色谱柱30min以上（如用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗30min以上），再更换为分析流动相。
B、如果流动相中含有缓冲盐，请使用过渡流动相过渡后再换分析流动相平衡；
正确使用缓冲盐，正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过渡，使用后要冲洗。具体方法如下：
注意：过渡流动相是指有机相和水相比例与分析流动相相同比例，只是不含有缓
冲盐；
阿奇霉素新柱：建议在正常平衡后增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）冲洗17小时
C、注意事项。
C.1除 AQ外（可耐100%纯水），其它反相柱应避免使用纯水相，有机相比例建议在5%以上。即使AQ也应避免长时间使用100%水冲洗。如果一定要用100%水作为流动相，请在酸性条件下使用磷酸盐缓冲液，这样能延长色谱柱寿命。
C.2请注意色谱柱的pH、压力耐受范围，如超出范围或变化幅度较大会引起重现性变差、色谱柱提前劣化等问题。
C.3在有机溶剂含量少、色谱柱温度高的条件下，耐酸耐碱性能会降低。
C.4使用含有离子对试剂等表面活性剂的流动相，色谱柱的寿命会变短。
C.5请使用与分析柱相同填料的预柱，否则可能无法得到正常的色谱峰。
C.6.在使用了TFA等强有机酸或碱(pH>8)的流动相之后，请使用与所选用的流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液进行置换。若是一周以上的长期保存，请进一步使用乙腈进行置换，并用附带的堵头密封，保存在冷暗处。
C.7通常的冲洗可使用高水相-高有机相-有机相（乙腈或甲醇）依次冲洗。在甲醇、乙腈冲洗过程中，重复注入100～200μl四qi呋喃或异丙醇可有助于去除强疏水性物质。
C.8当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时，处理方法如下：将色谱柱反向连接接(询问厂家)，不接检测器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速冲洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速冲洗1h以上→然后正向连接好色谱柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速冲洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速冲洗1h以上
2、SCX 氢型阳离子交换柱。
A、每次使用时请一定避免直接使用含无机盐的流动相，避免盐析。可使用高水相过渡后再使用分析流动相。（葡jia胺样品新柱子，用60%乙腈/40水过渡半小时（正常流速即可），后再直接用葡jia胺流动相平衡即可0.2ml流速平衡过液，冲洗也一样先用60%乙腈40水，低流速冲半小时，后转到100乙腈）
B、离子交换柱的平衡时间较反相柱更长，请在分析前保证充分的平衡。
C、.离子交换模式中，洗脱行为一般随以下几点发生大幅变化：
①pH ②盐浓度 ③有机溶剂量 ④盐种类
*为了使样品充分离子化，流动相pHhao与样品的pKa相差 2.0以上
D、短期保存时，请使用含盐的水系流动相来保存；长期保存时，请用出厂（或咨询厂家）流动相纯乙腈来保存。注意拧紧柱两端自带堵头，防止溶剂挥发。
3、NH2色谱柱。
A、每次使用时请注意避免盐析。
B、弱阴离子交换模式中，一般随以下几点洗脱行为发生大幅变化：
①pH ②盐浓度 ③有机溶剂量 ④盐种类
*为了使样品充分离子化，流动相pHhao与样品的pKa相差 2.0以上
C、HILIC模式中，建议使用乙腈作为有机溶液。乙腈量增加，保留能力增大。
D、糖类的分析
①请设定乙腈/水的流动相条件。乙腈的浓度越高，则对糖的保留能力越强。
②若采用含甲醇或缓冲盐的流动相，峰会展宽。
③将其他公司硅胶类NH2色谱柱流动相条件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重现几乎相同的色谱图。
④若将糖的水溶液作为样品注入，谱峰会展宽。请使用含乙腈50%以上的溶剂来配制糖类样品。
⑤曾在酸性条件下使用过的色谱柱，糖类分析的保留时间、峰形会发生变化。
E、离子型物质的分析
①请设定乙腈/磷酸缓冲液且具有一定pH值的流动相条件。
②考察流动相条件时，按照pH由高到低的顺序进行考察。如果曾经在低pH下使用，填料的表面将无法回到初始状态。
③有时需要长时间平衡色谱柱(24小时以上)。平衡所需时间与通液量和盐浓度紧密相关，因此，时间紧急时请提高流速，或pH不变而增加流动相的盐浓度来进行平衡。
④抗坏血酸的色谱峰有时会出现拖尾现象(样品氧化)。
F、尿囊素的分析
尿囊素在pH 2～8范围内未离子化，请使用磷酸缓冲液作为流动相进行分析。
流动相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)
G.一个月以内的保存，请使用与所选用流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液（不含酸、无机盐）进行置换，请避免只用水进行置换；一个月以上的长期保存，在进行了上述处理之后，请用出厂时的溶剂（乙腈）置换并保存
四、 色谱柱的再生
色谱柱经过一段时间的使用，会出现柱压升高，柱效下降，一种可能是烧结滤片被堵塞；另一种可能是大分子进入柱内， 使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能是柱头塌陷，死体积增大。您也可尝试用下面列举色谱柱再生的方法处理色谱柱。
A、反相色谱柱的再生：
用以下溶剂至少各30mL冲洗色谱柱(分析柱)
100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%异丙醇→100%异丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%异丙醇→75%乙腈+25% 异丙醇→100%乙腈
*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱, 则在重新使用反相流动相以前, 必须用异丙醇冲洗色谱柱!!!
一般情况下 ,极性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色谱填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色谱柱体积的正已烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇冲洗色谱柱(因异丙醇的粘度较大 ,冲洗过程中随时注意调整冲洗流速) ,然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱柱。
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