高效液相色谱法—检测黄曲霉毒素残留
1.原理
样品经有机溶剂提取、净化和衍生化反应后，浓缩液注人HPLC仪，经色谱柱分离，分离出的组分依次进人荧光检测器(发射波长360 nm、激发波长245 nm)，产生相应的电信号，由记录仪记录响应信号，经微处理机自动计算及打印出样品中AFT含量(ng)。
2.仪器
HPLC仪(具荧光检测器)。
3.试剂
①硅镁型吸附剂：100-1200目，350℃烘2 h，冷后装入密闭容器中，用前加水15％减活，平衡48h。可谇续傅用7天。
②流动相：甲醇+0.01mol·L-1 KH2P04(1+1)溶液配制后，经0.45 um滤膜抽滤并脱气。
③层析柱，底层和上层为2.cIn厚的无水Na2S04，中层为0.4 g硅镁吸附剂，均以氯仿湿润。
④其他试剂参照薄层层析法。
4.仪器工作条件
①具荧光检测器(激发波长245 nm、发射波长360 nm)。
GAIN置16，Span置Max。
柱：C18 10um(Radial pak cartridges)。
流动相：甲醇+0.01tool／L KH2P04(1+1)。
流速：1.3 mL／min。
②进样量：10 uL。
5.检测步骤
①样品提取与净化：准确称取样品10 g于具塞锥形瓶中，加50 mI。氯仿，振荡30 min，过滤于层析柱中，用氯仿+正己烷(1+1)8 mI，，氯仿+甲醇(9+1)10 mL，淋洗除杂质，最后用20 mL丙酮+水(99+1)洗脱黄曲霉毒素，收集于烧杯中，在50℃水浴中挥干溶剂，再用氯仿分次将残渣洗人2 mL具塞试管中，并于50℃水浴中通Nz吹干。
②衍生化反应：向具塞试管中加200uI。正己烷，50uL三氟乙酸，将盖盖紧，充分混匀1 min，静置30 rain后用Nz吹干。加100uL流动相，充分混匀，待检。
③标准液的处理：取适量标准溶液，按样品处理方法萃取、净化和衍生化反应，定容，使AFTBl、AFTMl最后浓度均为0.1 ng·uL-1。
AFT保留时间及标准色谱图：保留时间(min) ：AFTM1 3.36，AFTG1 4.72，AFTB1 16.00，FT G2 10.12，AFTB2 14.40。
6.说明
①本法应在1天内完成检测，否则结果偏低。
②层析柱中硅镁吸附剂应先用氯仿调为糊状加入。
高效液固色谱仪是利用样品各组分在固定相和流动相中吸附－解吸作用的差异，使各组分在作相对运动的两相中反复多次受到吸附－解吸作用而达到相互分离。 主要类型： 液固吸附色谱 1.1分离原理液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的，其固定相是固体吸附剂。 1.2固定相；吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类。 1.3流动相；流动相要求： 1.3.1选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性 1.3.2选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。 1.3.3选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱。 1.3.4选用的溶剂应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。 1.3.5选用的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。 1.3.6应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全 1.4应用：液固色谱是以表面吸附性能力为依据的，所以它常用于分离极性不同低的化合物，也能分离那些具有相同极性基团，但数量不同的样品。 液液分配色谱 1.1分离原理；分配色谱法的原理与液液萃取相同，都是分配定律。 1.2固定相；分配色谱固定相由两部分组成，一部分是惰性载体，另一部分是涂渍在惰性载体上的固定液。 1.3流动相；分内色谱中，要求流动相尽可能不与固定液互溶 1.4应用；既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物。由于不同极性键合固定相的出现，分离的选择性可得到很好的控制。 键合相色谱 1.1分离原理 1.1.1正键合相色谱分离远离：使用的是极性键和固定性，溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。 1.1.2反键合相色谱分离原理：使用的是极性较小的键合固定相，其分离机理可用疏溶剂作用理论来解释。 1.2固定相；按极性大小可分为非极性、弱极性、极性化学键合固定相三种。 1.3流动相 1.3.1正键合相色谱中，采用和反相液液分配色谱相似的流动相，流动相的主体成分为己烷或庚烷。 1.3.2反相键合相色谱中，流动相采用和反相液液分配色谱相似的流动相，主题为水。 1.4应用 1.4.1正键合相色谱法的应用：多用于分离各类极性化合物如染料、炸药、多巴胺、氨基酸等； 1.4.2反键合相色谱法的应用：由于操作简单，稳定性和重复性好，该方法已成为一种通用型液相色谱分析方法。在生物化学、医药研究、食品分析和环境污染分析等多个领域有了很大的应用和发展。 凝胶色谱 凝胶色谱又称分子排阻色谱，它是按照分子尺寸大小顺序进行分离的一种色谱方法。凝胶色谱法的固定相凝胶是一种多孔性的聚合材料，有一定的形状和稳定性。根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可以分为两类：即用水溶剂做流动相的凝胶过滤色谱法（GFC）与用有机溶剂如四氢呋喃做流动相的凝胶渗透色谱法（GPC）。
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