高效液相色谱法中反相柱的清洁和再生 液相色谱技术指标

     反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。固定相上还有少数物质，如混合相（例如苯基－己基）、末端封闭和非末端封闭种类和极性嵌入相－也存在于这些键合硅胶上。还有很多填料用于反相色谱，包括聚 合物，聚合物表面涂上硅胶和氧化铝，无机－有机混合物，涂层氧化锆，和石墨化碳。不同种类的固定相有他们自己的优点和缺点。

      反相色谱柱利用各种流动相和添加物可以有很多的应用。一些技术利用添加物可以改变或修饰填料的表面。有时候这些添加物有可能会污染键合相表面。硅胶表面因为有着疏水键合相而有一些别的化学性质。残留的硅烷醇存在于所有的硅胶键合填料中。这些硅烷醇具有弱酸性，因此能与某些待分析物合基质成分，特别 是碱性成分。因为硅烷醇的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生因此与阳离子产生静电相互作用就有可能发生。较老的A型硅胶能容纳高浓度金 属离子（有时候100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大甚至能发生金属鳌合现象或清除一些化合物。残留硅烷醇在非末端封闭的硅胶合短链键合相如 C2或C4上更让人烦恼。使用者必须清楚他们所用的固定相表面特殊性质和可能的分析物－固定相表面的相互作用，这样当他们使用反相方法时才能考虑到可能的基质相互作用。例如，非常 疏水的样品基质如玉米油，高芳香物质，和蜡能粘住固定相装填表面并且改变他们的性质。含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。尽管分析者想尽最大努 力来保护HPLC柱子，某些分析物－基质污染能使固定相受到有害的影响。当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的柱子能产生反压问题。 被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。这部分的"柱子观察"将讨论可行的方法使柱子回复原来的或差不多原来的状态。因为键合硅胶柱子是 较受欢迎的，我重点讲述这种柱子。

       最后，我将讨论别的反相柱子的清洁步骤。 什么导致反相柱子污染产生？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。 有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90～100％的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢 呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头 堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗5～10个体积以后才更换强溶剂。有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子了，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质 如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。

      清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如， 异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列： 100％甲醇 100％乙晴 75％乙晴－25％异丙醇 100％异丙醇 100％二氯甲烷 100％正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗10个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC 分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速来冲洗，要回复原来的溶剂体系，不需要每一步都冲洗，可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没 有缓冲的流动相，最后回复起始流动相配置。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果使用者怀疑柱子被严重污染，可以二甲基亚砜（DMSO）或 者二甲基甲酰铵和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作。

    自动进样器的故障容易被发现，有时液相色谱仪系统出了故障而不能确定是否是进样器故障，可以用手动进样几次，或用一台好的自动进样器代替，如排除了故障，说明自动进样器有了问题。不同厂商的自动进样器差异很大，除一些共性故障外，较好查阅操作手册或与供应商联系。

    除自动进样器机械、控制系统可能出现故障外，在操作及方法学方面也可能出现相应的问题，这里主要根据自动进样器的设计特点，对试验过程中可能出现的问题进行说明。

    一、滞后体积

    高效液相色谱仪中滞后体积是指流动相混合器到柱头的体积，包括溶剂混合器和混合器到柱头之间连接管的体积，对于低压混合系统，也包括泵体积。滞后体积较大可能导致实验的重复性差、方法移植困难。通常的HPLC系统中，滞后体积一般在0.2mL～5mL之间，主要取决于装置的设计。

    滞后体积中较重要的部分为自动进样器的定量环体积。只有定量环体积小于100μL时，其对滞后体积的影响才可以近似不计。当定量环体积较大时，这种影响将表现出来。例如，采用50μL的定量环时滞后体积为300μL，如果改用1mL定量环，滞后体积将变成1250μL，这种变化直接影响到色谱分离结果。在实际分离过程中，采用的色谱柱较细时，必须考虑滞后体积的影响，解决的办法为更换较小的定量环，减小滞后体积。

    二、样品瓶过满

    如果样品瓶过满，在瓶盖较紧、进样量较大的情况下，可能会导致进样重复性变差。其原因为样品瓶中的样品被抽出时，盖紧的瓶盖不能使空气及时进入，造成部分真空。由于这种真空作用，注射器不能够吸取足够量的样品体积。在极端的情况下，对于挥发性稀溶液样品，针内甚至会出现气泡，影响分析工作的正常进行。

    有些自动进样器采用加排空针的方法克服这一问题，但这种方法并不常用。较简单的解决办法为不要使样品瓶过满。一般装样量在样品瓶的1／2到3／4之间较为适宜。

    三、进针深度的调节

    样品量足够多时，不必考虑这一问题。但对于痕量分析而言，进针深度的调节问题将较为突出。理想的情况下可以使进针深入到接近样品瓶底部，这样可以较大限度地利用样品。当可用的样品体积有限时，可以采用微量样品瓶以增加给定体积样品的相对深度。如果进针过深，可能插入样品瓶的底部，甚至导致针尖阻塞。如果进针深度不足，样品只及针尖部分，针将不能抽取足够量的样品，部分空气取而代之。

    对于进针深度的调节，一般采用机械或电动的方法，目前大部分厂商可以在液相色谱仪色谱工作站上设置。无论采用哪种方法，实验之前都必须认真调节，更换样品瓶类型时还需要重新调整。

三个延长液相色谱柱使用寿命的方法

　　色谱柱是化学实验中较为常见、常用的化工仪器之一，正确而有效的使用方法，不仅能够延长色谱柱的使用寿命，也能确保试验的准确性。

　　1、“保护柱”的使用

　　保护柱是很短的色谱柱，填装和液相色谱柱相同的填料。正确使用”保护柱”，可以起到阻拦一些容易损坏液相色谱柱的物质的作用。从而达到延长柱子寿命的效果。相反，如果使用”保护柱”不当，可能会缩短色谱柱的使用寿命。例如，在保护柱使用过程中，如果污染达到一定程度而没有及时更换，累积的杂物很可能会冲入色谱柱中，反而会造成色谱柱损坏。因此，在使用”保护柱”时，较为重要的是要知道什幺时候该换保护柱。该换的时候就必须要立即更换。

　　2、选择高品质的柱子

　　一般认为同一厂牌、同一型号的柱子之间的品质都相同，对品质管理很严格的厂家而言，这说法是成立的。但如果厂家品质管理不够严格，即使是同一批号的新柱子之间的品质也有差异。所以，选用柱子时必须选择管理严格的高品质柱子，我们知道，任何柱子使用过后都会产生变化。尤其如在强酸或强碱条件下使用，柱子更易产生变化。因此，应尽量选用pH适用范围大的柱子。在开发新分析方法时，许多专家建议不要使用旧柱子。因柱子一经使用。柱性会改变；如此一来，使用旧柱子开发出来的新分析方法，很可能在再使用同厂牌的新柱子分析时。发生无法达到预定效果的情况。总的说。开发新分析方法时要使用品质好的新柱子；并且一支柱子可以使用在一种分析方法上；则柱子寿命可以延长。

　　3、定期冲洗色谱柱

　　一般柱子使用一段时间后总会有一些杂质累积在柱内，而且这些杂质不会随着流动相出来，会逐渐影响柱子的品质。这些杂质在后来的分析谱图上出现。从而造成出现怪峰、基线不平等现象。简单的解决方法是用较强的流动相冲洗。而且每次分析某一产品完成后冲洗。如果分析时使用缓冲剂﹐可以用水来取代缓冲剂。先使用有机和水的混合溶液为流动相冲洗缓冲剂。接着再用100%有机溶剂冲洗。如果直接用100%有机溶剂冲洗的话，缓冲剂很可能会沉淀出来，而损坏柱子的品质。使用10-20倍柱体积的量来冲洗基本就足够了。可以将100%有机溶剂冲洗的条件加在分析实验程序完毕后，如此一来每天在开机前都会用100%机溶剂冲洗。一般硅胶柱可以反冲洗处理﹐即是在将冲洗前将柱子倒反接后再冲洗。打算使用反冲洗处理前，可以先参考柱子的保养说明书。所以要真正保护柱子，使柱子的寿命延长，可以是使用”保护柱”和定期冲洗柱子。