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化妆品中二十一种磺胺的液相色谱仪测定 液相色谱是如何工作的

时间:2020-08-31    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

测定化妆品中二十一种磺胺的液相色谱仪

二十一种磺胺物质是我国《化妆品卫生规范》贵的的禁用物质,部分作为化妆品生产原料即添加组分添加到化妆品中。如果技术上无法避免禁用物质作为杂志带入化妆品时,测化妆品成品应符合《化妆品卫生规范》对化妆品的一般要求,即在正常及合理的可预见的使用条件下,不得对人体健康产生危害。
目前我国尚未规定这些物质的限量值,本标准的定义,仅对化妆品中测定这些物质提供检测方法。
化妆品中二十一种磺胺的测定高效液相色谱法
 
1 范围
    本标准规定了化妆品中二十一种磺胺的测定高效液相色谱法。
本标准适用于化妆品中二十一种磺胺的测定。
2 规范性医用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用贰成为本标准的条款。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
 
3 原理
试样经溶剂提取,离心过滤后,用高效液相色谱测定,外标法定量,液相色谱-质谱确认。
4 试剂和材料
除非另有说明,所有试剂均分析纯,水为GB/T 6682贵的的一级水。
4.1 甲醇:色谱纯。
4.2 四氢呋喃:色谱纯。
4.3 氢氧化钠溶液(0.1mol/L):准确称取4g氢氧化钠于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后备用。
4.4 甲酸溶液(0.1%):准确量取1ml甲酸于1L容量瓶中,用水定容至刻度,混匀后备用。
4.5 甲醇水溶液:准确量取50ml甲醇和50ml水,混匀后备用。
4.6 磺胺胍、磺胺、磺胺醋酰、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基吡啶、磺胺二甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲嘧啶、磺胺唑噁啉、磺胺硝苯、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺领苯二甲氧嘧啶、磺胺二甲异噁唑标准品:纯度大于97%。
4.7 二十一中磺胺标准储备液:准确称取每种磺胺标准物质(4.6)各100mg,分别置于100ml棕色容量瓶中,用甲醇水溶液(4.5)溶解并定容至刻度,摇匀,配置成浓度分别为1000ug/mL的标准储备液,于4℃避光保存,可使用三个月
注磺胺噁唑标准储备液配置时,可加入数滴氢氧化钠溶液(4.3)辅助溶解。
4.8 二十一种磺胺的混合标准储备液:分别准确移取二十一种磺胺标准储备液歌4ml余100ml棕色容量瓶中,用甲醇水溶液(4.5)定容至刻度,该溶液中二十一中磺胺的浓度均为40ug/mL。
5 仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪(HPLC STI500二元梯度):配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
5.2 液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪:配有电喷雾离子源(ESI).
5.3 分析天平:感量为0.0001g和0.001g。
5.4 离心机:转速不低于5000r/min。
5.5 超声波水浴。
5.6 具塞比色管:10ml。
5.7 具塞塑料离心管:10ml。
5.8 微孔滤膜:0.45um,有机相。
6 分析步骤
6.1 样品处理
6.1.1 膏霜、乳业、水剂、散粉、香波类样品
称取1g(精确至0.001g)试样于10Ml具塞比色管中,加入5ml甲醇,再加水至10ml,超声提取20min。取部分溶液转移至10Ml具塞比色管中,以不低于5000r/min离心15min,上清液经0.45um微孔滤膜过滤,过滤液作为待测样液。
注:如离心难以得上清液可加适量氯化钠破乳。
6.1.2 唇膏类样品
称取1g(精确至0.001g)试样于10Ml具塞比色管中,加入2ml四氢呋喃,超声提取10Min,再加水至10Ml,超声提取10min。取部分溶液转移至10Ml具塞比色管中,以不低于5000r/min离心15min,上清液经0.45um微孔滤膜过滤,过滤液作为待测样液。
 
6.2 测定条件
高效液相色谱测定条件如下:
A,色谱柱:Vertex C18,5um,250mm×4.6mm(内径)。
B, 流动相见表1.
C, 流速:1.0ml/min。
D,柱温:32℃。
E, 波长:268nm。
F, 进样量:20ul。
 
表1流动相
步骤
时间/min
甲醇溶液(0.1%)/%
甲醇/%
0
0.00
92
8
1
7.00
84
16
2
13.00
78
22
3
18.00
75
25
4
27.00
75
25
5
29.00
45
55
6
40.00
5
95
7
42.00
92
8
 
6.3 标准曲线的绘制
用甲醇水溶液(4.5)将二十一种磺胺混合标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.1ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml的混合标准工作液,按6.2的测定条件浓度由低到高进样测定,以峰面积-浓度作图,得到标准曲线回归方程。
二十一种磺胺标准品色谱图见A.1
6.4 测定
按6.2的测定条件对待测样液进行测定,用外标法定量。待测样液中磺胺的响应值应在标准曲线的线性范围内,超过线性范围测应稀释后再进样分析。必要时,阳性样品需要用液相色谱-质谱确认试验(参见附录B)
 
6.5 空白试验
除不称取样品外,均按上述测定条件和步骤进行。
7结果计算
结果按式(1)计算,计算结果保留2为小数(计算结果应扣除空白值):
Wi=1000×Ci×V/m…..(1)
Wi—试样中被测磺胺的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)
Ci—从标准工作曲线上查出的样液中被测磺胺的浓度,单位为ug/ml
V—样液最终定容体积,单位L
m—试样的质量,单位g
 
8 检出限和定量限
本标准的检出限和定量:磺胺胍、磺胺、磺胺醋酰、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基吡啶、磺胺二甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲嘧啶、磺胺唑噁啉、磺胺硝苯的检出限为0.2mg/kg,定量限为0.6mg/kg;磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺领苯二甲氧嘧啶、磺胺二甲异噁唑的检出限为0.4mg/kg,定量限为1.2mg/kg。
9 回收率
在天津浓度为0.2mg/kg-40mg/kg浓度范围内,回收率在85%-110%之间,相对标准偏差小于10%。
10 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
附录B,详细请电话咨询:0571-85125980    http://www.hplc1718.com
关键词:二十一种磺胺,高效液相色谱法,化妆品新规,GB/T 24800.6-2009
 

  HPLC以它定量分析结果准确、分析周期短、分析范围广及分析检测限低等优势,在食品添加剂、药物成分分析等多领域得到了广泛的应用。本文就液相色谱仪在实际操作时应注意的事项及维护做了简单介绍。

  主要部件介绍

  输液系统

  输液系统主要包括在线脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置。在线脱气装置主要功能是流动相在进入柱子前排除气泡。液相色谱柱的填料颗粒小,通过 2~5 mm 的色谱柱受到的流动阻力很大,因此需要通过高压输液泵抽取流动相输送至色谱柱。

  高压泵按输液性能可分为恒压、恒流泵。按机械结构可分为:液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵。

  进样器

  进样器是将分析样品送入色谱柱的装置,分为手动、自动进样器两种。手动进样器一般配有20~100μL的定量环。

  色谱柱

  色谱柱以液体为流动相,以广义的固相为固定相来进行分析样品的分离工作。

  色谱柱按照分离模式大致可以分为正相色谱柱和反相色谱柱。

  检测器

  检测器是将色谱柱分离出样品的物理或化学特性转换为可以测量的电信号,通过色谱图记录下来,由色谱图中的峰形状判断分离效果,依据标物、分析样色谱图的出峰时间、峰面积分别对样品进行定性定量分析。

  维护及使用注意事项

  1.开关机操作注意

  分析准备工作做好后,依次打开稳压电源、高压输液泵、柱温箱、检测器,待各部件自检结束,打开连接仪器的电脑,启动工作软件。分析工作结束后,关闭工作软件,再依次关闭检测器、柱温箱和高压输液泵。

  2.对流动相的要求

  为保证液相色谱仪器的正常使用,所有流动相必须是色谱级的,且经过过滤杂质、排除气泡后装入干净的流动相贮存瓶中待用。

  (1)流动相的物理化学性能要求

  对分析物要有足够的溶解能力,以利于提高检验的灵敏度;流动相的黏度要小,以保证合适的柱降压;流动相的沸点要低,以利于制备分离时样品的回收;流动相的 PH 值一般应在 2~7.5;使用期限不得超过 2 天,否则产生细菌污染管路。

  (2)流动相的过滤

  流动相在使用前都必须经过滤,以除去杂质微粒。同时要定期清洗吸滤头,以防杂质通过其进入流动相。应依据其是否是水溶性选择水膜或有机膜(0.45 μm 或 0.22 μm),使用溶剂过滤装置,通过真空泵抽气过滤。

  (3)流动相的脱气

  流动相必须预先脱气,否则易产生气泡,影响泵的工作。此外,溶解在流动相中的氧能与某些有机溶剂形成有紫外吸收的络合物,提高背景吸收,会在梯度洗脱时造成基线漂移或形成鬼峰。常有的脱气方法有在线真空脱气法、超声波脱气法、抽真空脱气法三种。

  3.色谱柱的维护及使用注意事项

  所有分析样品把pH值调节到适合色谱柱的pH值范围内。进样要避免超负荷,这是保持色谱柱性能持久良好的重要方法之一。手动进样器进样的话,进样时动作要快速准确。分析物成分复杂时,要在色谱柱前加色谱保护柱以保护色谱柱。每次分析工作开始时,要对色谱柱进行平衡,用含10%流动相中的有机溶剂的水溶液进行排气和冲洗色谱柱和管路,冲洗30分钟左右,将色谱柱中的纯有机溶剂替换掉,然后再用至少10倍柱体积的流动相平衡色谱柱,直至基线平衡后方可进样。

  每次分析工作结束后,一定要立即用一定量的水溶液彻底冲洗色谱柱中的缓冲盐液,再用对被测物洗脱能力强的溶剂来冲洗色谱柱,冲洗时间不能小于1小时,洗脱溶剂的用量至少为柱体积的20倍。若不及时冲洗色谱柱,杂质长时间积累在其中,易堵塞色谱柱,降低柱效性能。长期这样,会加速减少色谱柱使用寿命。色谱柱4天以上不使用,应从仪器上取下,用封头螺帽把两头紧紧密封。色谱柱保存时注意不要强烈震动、碰撞。

  4.高压输液泵的维护及使用注意事项

  每次分析工作结束后,都应及时清洗泵。当有缓冲盐做流动相时,缓冲盐与有机溶剂互相交换前一定要用5%的甲醇水溶液清洗泵,防止盐在有机相中结晶损坏泵中各组件。缓冲盐溶液的浓度不要过高,要控制在5%以下,否则高浓度的缓冲盐会磨损密封垫和活塞,降低其使用寿命。长时间使用高浓度的缓冲盐,必须用10%的异丙醇色谱级溶液清洗泵,从而保护柱塞和密封垫。

  输液泵工作前要设置工作压力范围,正常工作压力一般不要超过 30 Mpa,否则经常高压会使密封环变形,产生漏液。平时分析工作要养成记录压力的好习惯,这样如果工作压力超过平时正常压力的10%~15%,就应及时查找原因。

  5.紫外检测器的维护及使用注意事项

  紫外检测器有一定的使用寿命,所以平时应尽量减少氘灯的使用时间,在柱平衡进行一大半之后,在走基线之前,打开检测器光源;分析结束后即可关闭检测器光源。要保持检测器四周环境清洁,实验室尽量少开窗户,定期地面进行吸尘工作,防止检测器工作时由于静电吸附灰尘颗粒覆盖在光学元件上。检测器池内存在气泡就会产生噪音,噪音会干扰定量分析,所以流动相须充分脱气后再使用。

  应定期清洗流通池。如观察到流通池内部无气泡或脏物,应清洗流通池。通过注射器用异丙醇等有机溶剂冲洗池内,以清洗透镜。如是含有缓冲盐的溶剂作流动相,应在使用异丙醇冲洗前用水替换池中原先有的溶剂。

 

  气相色谱是二十世纪五十年代出现的一项重大科学技术成就。这是一种新的分离、分析技术,它在工业、农业、国防、建设、科学研究中都得到了广泛应用。同为色谱技术之一,液相色谱也是一种分离与分析技术,它的特点是以液体作为流动相,固定相可以有多种形式,如纸、薄板和填充床等。那么,气相色谱和液相色谱相比各有什么特点呢?可以从以下几个方面进行考察:
 
  一、流动相
 
  GC用气体作流动相,又叫载气。常用的载气有氦气、氮气和氢气。与HPLC相比,GC流动相的种类少,可选择范围小,载气的主要作用是将样品带入GC系统进行分离,其本身对分离结果的影响很有限。而在HPLC中,流动相种类多,且对分离结果的贡献很大。换一个角度看,GC的操作参数优化相对HPLC要简单一些。此外,GC载气的成本要低于HPLC流动相的成本。
 
  二、固定相
 
  因为GC的载气种类相对少,故其分离选择性主要通过不同的固定相来改变,尤其在填充柱GC中,固定相常由载体和涂敷在其表面的固定液组成,这对分离有决定性的影响,所以,导致了种类繁多的GC固定相的开发研究。迄今已有数百种GC固定相可供我们选择使用,但常用的HPLC固定相也就十几种。故LC在很大程度上要靠选用不同的流动相来改变分离选择性。当然,毛细管GC常用的固定相也不过十几种。在实际分析中,GC一般是选用一种载气,然后通过改变色谱柱(即固定相)以及操作参数(柱温和载气流速等)来优化分离,而LC则往往是选定色谱柱后,通过改变流动相的种类和组成以及操作参数(柱温和流动相流速等)来优化分离。
 
  三、分析对象
 
  GC所能直接分离的样品是可挥发、且热稳定的,沸点一般不超过500℃。据有关资料统计,在目前已知的化合物中,有20%~25%可用GC直接分析,其余原则上均可用LC分析。也就是说GC的分析对象远没有LC多。需要指出的是,有些虽然不能用GC直接分析的样品,通过特殊的进样技术,如顶空进样和裂解进样,也可用GC间接分析。比如高分子材料的裂解色谱就是如此。这在一定程度上扩大了GC分析对象的范围。此外,GC比LC更适合于气体的分析。
 
  四、检测技术
 
  GC常用的检测技术有多种,比如热导检测器(TCD)、火焰离子化检测器(FID)、电子俘获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)等,其中FID对大部分有机化合物均有响应,且灵敏度相当高,小检测限可达纳克级。而在LC中尚无通用性这么好的高灵敏度检测器。商品LC仪器常配的也就是紫外-可见光吸收检测器(UV-Vis)和示差折光检测器(RI)。前者的通用性远不及GC中的FID,后者的灵敏度又较低,且不适于梯度洗脱。当然,不论GC还是LC,都有一些高灵敏度的选择性检测器,GC有ECD和NPD等,LC有荧光和电化学检测器。较为理想的检测器应该首推MS,但在这一点上,GC目前要优于LC。因为GC流动相的特点,它与MS的在线联用已不存在任何问题,特别是毛细管GC与MS的联用已成为常规分析方法。而LC与MS的联用就受到了流动相的限制。虽然目前已有多种接口,如离子束、热喷雾、电喷雾等,但流动相的选择还是受到明显的限制。
 
  五、制备分离
 
  在新产品的研究开发过程中,或在未知物的定性鉴定工作中,常需要收集色谱分离后的组分作进一步分析,而某些高纯度的生化试剂则是直接用色谱分离来制备的。就这一点而言,GC在原理上应该是有优势的,因为收集馏分后载气很容易除去。然而,由于GC的柱容量远不及LC,如果用GC作制备,那是相当费时的。因此,制备GC的实用价值很有限。制备LC则有很广泛的应用。

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