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色谱柱的使用 色谱柱如何操作

时间:2020-08-31    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

色谱柱的使用

色谱柱在使用前,可以进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理
 a、可以使用流动相溶解样品。
 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
 c、使用0.45?m的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
  液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:
  a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
  b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
  c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
  d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
  e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。
  f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
  因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求较佳柱效,可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。
  当选用较佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

疏水色谱柱是利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同,用流动相洗脱时,各组分迁移速度不同而达到分离的目的。流动相一般为pH 6-8的盐水溶液,具有对蛋白质的回收率高,蛋白质变性可能性小等优势。由于流动相中不使用有机溶剂,也有利于蛋白质保持固有的活性。 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术,使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面,成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等,以及一些药物分子,甚至细胞等分离时的有效手段。 疏水色谱柱的影响因素有哪些? 1、盐类和盐组成盐的摩尔表面张力增大,蛋白质在疏水层析柱内的吸附能力相应增大。各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列的能力。 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有为重大的影响。选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。 2、离子强度离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值,降低离子强度来提高组分的解析附能力。HIC实验中,改变离子强度进行洗脱的方式,一般宜采用梯度洗脱法,可提高分离的选择性。 3、溶液的酸碱度溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况,溶液的pH接近蛋白质的等电点,其疏水性增加,有利于与固定相配基相互作用;远离其等电点,其疏水性减少,不利于与固定相配基结合,但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。 4、柱温一般柱温升高,生物大分子的构象会发生变化,疏水作用增加,吸附能力增加,有利于提高层析柱的分离度,所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用,分离性质相近的化合物,如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类,在高温条件下易变性失活,因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。
  什么情况下需要对色谱柱做老化处理
检测色谱柱安装和系统检漏工作完成后,就可以对色谱柱进行老化了。
1.老化的方法:
老化的方法通常是将色谱柱升至一恒定温度,通常为其温度上限。特殊情况下,可加热至使用温度之上约10~20℃左右,但是一定不能超过色谱柱的温度上限,那样极易损坏色谱柱。
当到达老化温度后,记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升,在到达老化温度后5~10分钟开始下降,并且会持续30~90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2~3小时后基线仍无法稳定或在15~20分钟后仍无明显的下降趋势,那么有可能系统有泄漏或者污染。遇到这样的情况,应立即将柱温降到40℃以下,尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化,不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。
另外,老化的时间也不宜过长,不然会降低色谱柱的使用寿命。一般来说,涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长,而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。
2. 设置确认载气流速
对于毛细管色谱柱,载气的种类高纯度氮气或氢气。载气的纯度大于99.995%,而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是毛细管色谱柱,那么依照载气的平均线速度(cm/sec),而不是利用载气流量(mL/min)来对载气做出评价。因为柱效的计算采用的是载气的平均线速度。推荐平均线速度值:氮气:10~12cm/sec;氢气:20~25cm/sec。
在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命,而且很大程度的降低了背景噪音。建议安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用ECD系统时,能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。
3.柱流失检测
在色谱柱老化过程结束后,利用程序升温作一次空白试验(不进样)。一般是以10℃/min从50℃升至使用温度,达到使用温度后保持10min。这样我们就会得到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。
在空白试验的色谱图中,不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰,通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下,色谱柱的性能开始下降,基线的信号值会增高。另外,如果在很低的温度下,基线信号值明显的大于初始值,那么有可能是色谱柱和GC系统有污染。
色谱柱的保存色谱柱用进样垫将色谱柱的两端封住,并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分,以确保没有进样垫的碎屑残留于柱中。
色谱柱的重新安装色谱柱重新安装时,密封要注意:
a.安装位置(尺寸)要重现,否则引起峰灵敏度变化;
b.安装时防止碎渣进入色谱柱引起峰形拖尾;
c.不需要拧得太紧;
e.使用清洁的密封垫,避免用手接触密封垫,以防手上的油脂污染;
f.密封垫安装前,要仔细检查有无损伤,以防安装后,有问题时不易拆除;
g.对那些不宜重复使用,如石墨密封垫,重新安装柱时要注意及时更换。



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