高效液相色谱法分析中药及植物药的进展 液相色谱如何做好保养

 高效液相色谱法分析中药及植物药的进展
  引 言
  植物药越来越受到人们的重视。据报道，全世界大约有70%的人口医疗依靠各种类型的植物药〔1，2〕。对植物药的兴趣主要基于以下两个原因，一是人们普遍认为植物药具有较小的毒性，二是用合成方法寻求新药物的可能性变得越来越小，同时已有的西药对一些疑难病症无能为力。随着对植物药需求的不断增长，开展植物药的药代动力学、毒理学研究和质量控制，开发快速、灵敏、具有选择性的分析方法也越来越迫切。过去20年的实践经验表明，高效液相色谱（HPLC）是一种非常有效和普遍适用的植物药分析方法。近来，由于各种分析柱、高选择性和高灵敏度的检测器和复杂的商品化仪器联用系统的出现，植物药分析领域已被大大地推进。本文就HPLC在中药及植物药研究中应用的较新进展做简要评述。

  2　色谱技术方面的进展

  2.1　固定相

  在过去的几年里，出现许多适于碱性物质分离的商品色谱柱, 其填料具有更好的重现性、更高的耐酸碱稳定性以及不易受次级保留影响。此外，使用新的固定相载体和将各种配体键合到常用的载体上，从而提高了反相色谱、离子色谱、离子交换色谱填料的选择性。与此同时，新的手性固定相不断出现，应用范围不再局限于个别的化合物〔3〕。

  Theodoridis比较了专门为碱性化合物的HPLC分析设计的新柱添料，其中包括有硅胶基体的C18-羟基、硅胶基体的C18和C8、硅胶基体的甲基苯基-丙基甲硅烷基、以氧化铝和聚苯乙烯-二乙烯基苯为基体的聚丁二烯填料。在每个被检验柱子上进行了流动相优化，并研究了流动相pH、有机改性剂性质、含量和盐浓度对保留选择性和分离度的影响。实验表明，当基于分析物间pKa值的差异进行分离时，洗脱液的pH值是影响分离的一个重要因素。碱性化合物在这样的C18柱和聚合物柱上能得到满意的分离结果，这些新柱填料已被用于金鸡纳生物碱和长春花生物碱的分析〔4，5〕。

  众所周知，光学异构体有不同的药理活性。Kusu等〔6〕用一手性配位体交换柱，以1 mmol/L醋酸铜和20 mmol/L醋酸铵（pH=6.4）的混合水溶液为流动相直接拆分了柑橘属植物、中药材、中药中的脱氧肾上腺素光学异构体，在0.2～100 μmol/L浓度范围内有很好的线性(r=0.999)，检测限可达0.2 μmol/L (S/N=3)。

  一系列具有两个或三个活性中心的四环、五环长春花生物碱的立体异构体能够在手性α1-酸糖蛋白（AGP）和人血清白蛋白（HAS）柱上得到分离〔7〕。以磷酸盐缓冲溶液（pH 5～7）/乙腈（ACN）或异丙醇为流动相，比较两种柱上得到的谱图，发现这类化合物与AGP固定相有更大的亲合力。在应用范围和立体选择性方面，AGP柱都优于HAS柱。

  2.2　检测

 紫外检测仍是较为普遍的检测方法，与此同时其它检测方法显示出了不可替代的优越性。

  2.2.1　电化学检测器　Kusu和其合作者〔8〕在分析枳实和枳壳中的脱氧肾上腺素，N-甲基酪胺时发现电化学检测器不仅有特殊的选择性，而且具有很高的灵敏度，而以往用紫外检测需要复杂的样品预处理才能避免样品中其它组分的干扰。在Kaseisorb LC-ODS-120-5色谱柱上，以0.02 mol/L柠檬酸-0.02 mol/L NaH2PO4（7：3 V/V，pH=3）为流动相，检测电位1.2 V(vs. Ag/AgCl)，去甲肾上腺素为内标，脱氧肾上腺素、N-甲基酪胺的检测限分别为1.3 μg/L和1.2 μg/L。青蒿素及其类似物既无强紫外吸收也无荧光发色团，且没有合适的衍生反应，因此很难对它们及其代谢产物进行HPLC分析，Chan〔9〕用HPLC-电化学检测器（ECD）测定了血浆中的青蒿素。

 2.2.2　光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器已被普遍用于鉴别液相色谱的峰纯度和提高重叠峰的定量准确度〔10，49，63，64〕。美登（maytus）中的美登类化合物（maytansinoids）是一类很强的抗癌药物，这类物质具有很相似的结构，分子间的差异很小，给分析带来困难。Reich等人〔11〕利用Varian 9065二极管阵列检测器为这类物质建立了一个光谱数据库，即使在分析物没有得到基线分离的情况下，这一谱库也能大大简化在复杂植物萃取物的未知基质中识别已知化合物。在此基础上，分别在硅胶、双醇基、氨基和氰基柱上对这类物质进行了系统研究，基于分子大小和与固定相特效的相互作用提出了此类物质复杂的保留机理。

  2.2.3　蒸发光散射检测器（ELSD）　ELSD是一种质量型检测器，流动相被气流雾化后进入加热管，在管内溶剂被挥发，一束狭窄光通过分析物粒子后发生散射，散射光由光电倍增管收集，它的响应取决于被分析物粒子的大小和数目。由于ELSD只对不挥发的物质响应，其特点是，即使在梯度洗脱的情况下也能得到比较平稳的基线。现在这一检测器已被成功地用于不挥发物质的分析，如：糖类、脂类、活性剂等。人参是常用的强身滋补品，有抗疲劳、镇静、抗胃溃疡等效用。许多研究表明，这些药效源于活性组分人参皂甙。由于人参皂甙缺少发色团，用紫外检测器检测这类物质时，只能在短波区。在短波区内检测，用梯度洗脱同时分离多个人参皂甙时，基线漂移严重，影响分析的准确度。Park等〔12〕用HPLC-ELSD同时分离和测定了人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3 和Ri等。ELSD的管温设置在145℃，N2流量40 mm(转子流量计单位)，检测限在35～155 ng之间。此方法的灵敏度和选择性都优于HPLC-UV，在一次洗脱中完成主要人参皂甙的定量分析。

  2.2.4　质谱　近来，液相色谱-质谱（LC-MS）联用，尤其是液相色谱-质谱-质谱（LC-MS-MS），已成为发展较快的分析技术之一。样品引入由比较早的传送带到目前液体样品的直接引入，离子化技术由热喷雾（TSP）、连续流快原子轰击（CF-FAB）、粒子束接口（PB），发展到现在的大气压化学电离（APCI）和电喷雾离子化（ESI）。 PB 的缺点是对难挥发性物质的灵敏度低，因此不适于天然产物中极性物质的分析；热喷雾接口虽已成功地用于极性和难挥发物质的分析，但对操作条件却有很高的要求。CF-FAB克服了TSP 的一些缺陷，但设备上的要求又使这项技术的应用受到限制。电喷雾接口是在常温常压下离子从液相直接被引入，而大气压化学电离（APCI）的样品离子是经过化学电离产生的，离解过程对温度控制的要求不像TSP-MS那么严格，在同样的汽化条件下可用于更多化合物的分析。ESI过程取决于溶液的化学性质、待分析离子的电迁移和表面行为。与ESI相反，APCI过程则取决于气相的化学性质，如：气体的酸碱性〔13〕。在质谱中所采用的接口技术受样品极性的影响。随样品极性从非极性至离子型逐渐增加，按如下顺序采用相应的质谱接口：气相色谱（GC）、PB、TSP、APCI和ESI。APCI有较宽的使用范围，从非极性到离子型化合物都可分析〔14〕。

  新的接口技术和离子化方法的发展使HPLC-MS在分析化学上起着不可替代的作用。植物类天然产物成分复杂，甚至含有多达几千种组分，但往往只是一种化合物和植物的药效或毒性有关，因而在分离植物萃取物中的活性组分时，希望检测技术能为色谱峰提供尽可能多的定性信息。质谱技术部分地满足了这种需要。

  前面已经提到，人参皂甙是人参萃取物中的活性组分，由于它缺少发色团，限制了紫外检测器的应用。1995年Van Breemen等〔15〕采用电喷雾离子化法，首次将LC-MS技术用于分析人参粗提物中的人参皂甙。基于分子离子峰和基准物的保留时间等信息，未经衍生的人参皂甙Rg1、Re、Rd、Rc、Rb2和Rb1直接被检测出来。Chuang等用紫外和电喷雾质谱（ESI-MS）检测，测定黄连中的7种生物碱〔16〕。通过追踪选定的离子来解决重叠峰问题，用诱导碰撞分解反应获得单个组分的结构信息。50 min内分离测定了黄连粗提物中的Berberstine、黄连碱、小檗碱、巴马亭、药根碱、表小檗碱和非洲防己碱。Wada 等〔17〕用LC-APSI-MS测定了日本乌头中的生物碱。另有报道〔18〕用TSP-MS分析银杏中的银杏苦内酯，检测限可达1 ng，灵敏度可以和GC-MS相媲美。Gobbato等〔19〕为了克服紫外检测选择性低，二极管阵列检测对结构类似的双黄酮分辨不清等缺陷，用HPLC-TSP-MS分析了银杏提取物中的双黄酮。最近，Brolis等用HPLC-二极管阵列检测（DAD），HPLC-TSP-MS和HPLC-ESI-MS检测，在一个反相大孔C18柱上分析了连翘中黄酮类、萘蒽酮类、间苯三酚类等16种组分〔20〕。

  2.3　计算机模拟优化

  在分离复杂的混合物时，计算机模拟优化正在发挥着越来越重要的作用。DryLab是一个商品计算机软件，能够快速、系统地开发HPLC方法的专家系统。仅仅依靠两次预实验，便可得到有关色谱条件的大量信息。此软件已被广泛用于各种样品的HPLC分析方法的开发，如核酸、蛋白质及复杂的天然产物等〔21〕。Metzger等〔22〕用DryLab软件辅助优化，从而确定了较佳的梯度时间、陡度、洗脱液的pH、柱类型、流速程序等，对番泻果和叶中的17个蒽醌类化合物进行了分离测定。在两次预实验的基础上，一个常规控制银杏质量的HPLC分析方法的开发仅用了8 h，预测的可靠性令人满意，预测值和实验值之间的平均标准偏差小于0.4%〔23〕。另外，借鉴已有的分析黄酮的实验条件，Dzido用DryLab优化了分析蜀葵属植物中的黄酮类的梯度洗脱方法〔24〕。本实验室用DryLab开发了HPLC测定大黄中羟基蒽醌类化合物的方法。在优化条件下，对比了不同产地大黄中有效成份的差异，并考察了样品制备方法对提取效率的影响〔25〕。

  2.4　其它

  由于中药剂型的复杂多样，识别中药中的掺假物对于质检部门来说无疑是一个很大的挑战。商用系统REMEDI HS已被用于检查中药中人工合成的中性碱性掺假物〔2〕。这个系统包括一个在线样品净化装置和一个含有555个药物和代谢物的数据库。在消费者提供的五种中草药中苯甲二氮、利眠宁、sulpiride、etenzamide、咖啡因和胃复安等合成药物被识别出来。

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