高效液相色谱法检测蜜饯中甜蜜素实验方法
一、实验目的
1.检测蜜饯中的甜蜜素含量
2.验证并重现文献中关于甜蜜素检测的方法，并有针对性的作出改进。
二、实验原理
在酸性的介质中，甜蜜素经次氯酸钠溶液衍生，正己烷反相萃取衍生物N,N-二氯环己胺，在314nm波长下有最大吸收。
三、实验材料、试剂耗材及仪器设备
1.实验材料
某品牌珍珠梅
2.试剂耗材
2.1甜蜜素标准品乙腈(国药色谱纯)；超纯水(自制)；硫酸(优级纯)；次氯酸钠(有效氯含量超过5%)；正己烷(色谱纯)；针式过滤器(有机系和无机系)
2.2工作液
2.2.1甜蜜素母液：精确称取1.0000g甜蜜素标准品，置于100ml容量瓶中加水定容，配制成10.00mg/ml的母液
2.2.2硫酸溶液(1：1)：取10ml超纯水于50ml烧杯中，另量取10ml浓硫酸小心加入到水中，边加边搅拌，待温度降至室温后使用。
2.2.3甜蜜素工作液：取甜蜜素母液，分别用水稀释成0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/ml的标准工作溶液。
3.仪器设备
杭州赛析科技STI501液相色谱仪 （配UV501紫外检测器） N2000色谱工作站 DT-230A柱温箱；N2000色谱工作站（浙大）超纯水机；高速离心机；超声波清洗器；漩涡混合器
四、实验方法及步骤
1.实验方法
1.1制作系列梯度的甜蜜素标准工作曲线
1.2样品衍生化，检测浓度
1.3利用高效液相色谱法检测甜蜜素含量
色谱条件如下：
色谱柱：C18(2),4.6*250mm，5um
流动相：乙腈：水=80：20流速：1ml/min
进样量：20ul柱温：40摄氏度
波长：314nm
2.实验步骤：
2.1标准工作曲线建立
2.1.2分别精确吸取10ml甜蜜素标准工作液至50ml的带盖的玻璃瓶中
2.1.3分别加入2ml硫酸溶液(1：1)，5ml正己烷，1ml次氯酸钠溶液，旋紧盖子漩涡震荡1分钟
2.1.4吸取上层的有机相转移到另一只玻璃瓶中，加入30ml超纯水，漩涡震荡1分钟
2.1.5重复一次水洗过程，吸取上层有机相，0.45um滤膜过滤后进样检测
2.1.6根据检测数据，以样品浓度为横坐标，检测器的响应值为纵坐标建立标准工作曲线
2.2样品测定
2.2.1取10g的样品的果肉，用剪刀将其剪碎，置于100ml的烧杯中，加入50ml超纯水，浸泡2小时，在此期间每隔30分钟用玻璃棒搅拌一次。
2.2.2取上清液高速离心或用0.45um的滤膜过滤
2.2.3移取10ml离心或过滤后的溶液按照上述标准品的衍生方法处理，如果样品中的甜蜜素含量过高可稀释至合适的浓度，本实验根据实际情况将上清液稀释10倍，
2.2.4吸取衍生处理后的有机相层过滤，取20ul注入液相色谱仪检测
2.2.5根据实验数据采用外标法定量。
五、实验数据
1.甜蜜素标准品谱图相关信息
1.1标准品谱图
1.2甜蜜素系列浓度标准品叠加图
1.3标准工作曲线
2.样品谱图信息
序号文件名峰面积保留时间峰高半高峰宽浓度
1样2(稀释10倍)12327267.3341685212.96755.73546
2样2(稀释10倍)22249187.3591681712.55853.79997
3样2(稀释10倍)32237257.4311639212.81553.50424
4样2(稀释10倍)42281207.3781652112.96554.5937
5样2(稀释10倍)52242757.3711643712.81253.64058
6样2(稀释10倍)72241997.3861672212.58953.62174
7最大值2327267.4311685212.96755.735
8最小值2237257.3341639212.55853.504
9平均值226327.27.37716623.512.78454.149
10误差3511.60.032199.10.1770.87
11RSD1.55%0.43%1.20%1.39%1.61%
六、实验结论及分析
1.根据实验结果，此方法的线性工作曲线为：Y=4003.4X 8095.6,线性相关系数为：r=0.9999
2.根据样品的谱图信息，计算出珍珠梅的甜蜜素含量为：2.8g/kg，超出国家标准2.8倍(蜜饯国家标准为1.0g/kg)
七、实验讨论
1.该实验未作检出限、低浓度线性范围，但作为食品添加剂的甜蜜素来说，该线性范围及检出限足够，如需检测更低浓度的甜蜜素含量，该实验还要进一步优化。
2.该实验的优化过程中还缺少蜜饯中其他干扰物的影响，但据有的文献记载，在此色谱条件下，一些常用的食品添加剂并不影响甜蜜素的检测。
3.样品在在采集过程中要注意将其尽量粉碎，以获得尽量充分的提取，否则测得的甜蜜素含量偏低
4.色谱图中的主峰标注虽然是甜蜜素，但实际上是N,N-二氯环己胺。
5.样品在衍生化的过程需要特别注意的一点。很多样品中的成分比较复杂，在水浸提液中含有很多糖、氨基酸、蛋白质和脂类等有机化合物，这些物质在此衍生体系下可能会凝结成胶状物质影响甜蜜素衍生的回收率。因此，在这种情况下，我们有两种解决方法：一是将原浸提也稀释足够的倍数，使能产生胶状物质尽量少，但缺点对仪器的检测限的要求提高，如果采用浓缩精提还要增加前处理的步骤和成本；二是采用在衍生的中间过程超声震荡的方法消除因胶状物质引起的气泡，排除大部分干扰，有利于下一步的萃取。
6.需要说明的重要一点是，在进样之前一定要用有机滤膜过滤样品溶液，并且在色谱柱之前加上保护柱，虽然保护住的加入会引起峰的扩散。如果不未经过滤或为加保护柱，色谱柱极易被堵塞并且很难冲洗。
八、参考文献
1.何良兴，林赛君，柯春晖，郭柏坤高效液相柱前衍生法测定蜜饯中的甜蜜素分析检测2042009，Vol.30，No.04
2.甜蜜素试験法日食安监発第0829010号
使用前，要将液相色谱柱进行柱的性能测试，并保存结果，作为以后评价柱性能变化的参考。注意点：1.柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；2.为了测得的结果才有可比性，在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较佳条件)。
1、样品的前处理
a、可以使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵 的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求较佳柱效，可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用较佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水 可以使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。可以加入叠氮化钠，防止 细菌生长。
d．流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
关于液相色谱仪的选择
液相色谱仪是一种常见的色谱分析方法，与气相色谱相比液相色谱可以在常温中操作，且不受样品挥发度和热稳定性的限制。这使得液相色谱非常适合相对分子量较大，难汽化，不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物和高聚物的分离分析。 然而要选购一台品质优良的液相色谱并不容易。液相色谱仪的指标很多，有关于泵的、关于检测器的、关于色谱柱的……不过，从选购角度考虑，可以优先考虑噪音、漂移、最小检测浓度、定性定量重复性等主要技术指标。当然，这些指标都要放在系统、回路里去看去比较。 1.噪音 噪音指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动产生的声音。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果； 2.最小检测浓度(最小检测限) 最小检测浓度是反映仪器灵敏度的重要参数。根据公式CL=2×Nd×C/H(CL：最小检测浓度 Nd：噪音 C：样品浓度最小检测浓度 H：样品峰高)，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。如果选购的仪器回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音； 3.漂移 漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高分析效率； 4.定性定量重复性 主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分不错的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。虽然这些指标都属于检测器，但是就像前面所说的，条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。 例如：泵的脉动会直接影响噪音指标、泵的流量准确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标才可以反应出仪器的一些真实水平。 在选择仪器的时候需要充分考虑到仪器的方方面面才能拿到自己满意的机器。 首先从常规的几个部件做个简单的分析。 （一）输液泵应具备如下性能： ① RSD（流量稳定性）<0.3%; ② 流量范围宽， 0.1～5.0ml/min内连续可调，有的实验则需要更大流量; ③ 输出压一般应能达到150~400 kg/cm2,流量越大,最高压力越低; ④ 液缸容积小,有助于减少流动相死体积，利于清洗。 ⑤ 密封性能好，耐腐蚀。 （二）检测器 ①紫外检测器，分为可变单波长检测器VWD和二极管阵列检测器DAD，可以检测有紫外吸收的物质 ②荧光检测器，检测有荧光的物质 ③视差折光检测器，通用型检测器，但对环境要求极为苛刻，而且灵敏度低 ④ELSD，蒸发光散射检测器 ⑤MSD，质谱检测器 常用的是紫外检测，然后是MSD和ELSD （三）色谱柱 要求柱效高、选择性好，分析速度快等。目前市场上销售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、氧化铝、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。 一般的分析只需5000塔板数的柱效;同系物分析500即可;难分离物则可用2万的柱子。 因此一般10~30cm左右的柱长基本能满足复杂混合物分析的需要。所以要根据自己实际情况来选择合适的柱子。 柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到较佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使可以的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。 此外，温度在色谱分析中是个不容忽视的环境条件，环境温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。而且不同的检测器对温度的敏感度不一样。保持恒定的温度对实验而言是个绝对不容忽视的条件，因此也要留意注温箱的选择。以保证实验结果的准确性。 （四）进样器 进样装置要求：密封性好，重复性好，死体积小，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。而且进样方式多种多样，可分为隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。自动进样器则是市场发展的趋势。 （五）数据处理系统 一般专业的液相色谱仪生产厂家都有自己配套的液相色谱仪控制软件。但有不少液相色谱仪可以使用通用型的色谱数据工作站进行数据计算处理。进口软件价格比较高，这个自己得根据资金选择了。 二元泵和四元泵的区别二元有两个泵，泵后混合，气体的溶解度随压力的增大而增大，所以二元高压混合不会产生气泡。四元只一个泵（另外一个是辅泵），是泵前混合，在常压下进行的，两种液体混合时，会降低气体在混合溶液中的溶解度，通常会有气泡产生，所以四元低压梯度系统一定要配在线真空脱气机
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