色谱柱的性能
与液相色谱柱的性能相关的因素很多,基质(matrix)或者说担体、载体的化学性质、键合相(固定液)的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。
色谱柱填料可以由基质直接构成,如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等;也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成,如:较为经典的各种ODS柱、氨基柱、氰基柱等。
一、基质的特点:
1、 硅胶
硅胶是陶瓷性质的无机物基质,刚性大,不易变形。化学性质较稳定,但对于水溶液尤其碱性水溶液仍然是不稳定的,即使表面经过良好的化学键合,覆盖了固定液,还是要注意水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用,基质或者说是柱床(packed bed)溶解对色谱柱的影响是致命的。以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。纯硅胶填料适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物,硅胶也可以做凝胶色谱但柱效较低。硅胶基质键合固定相的高压液相填料,有其他填料无法比拟的高分离效能。
2、 二氧化铝
二氧化铝和硅胶相似,但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。所以,极少用作键合固定相的基质,也是适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物,尤其是分离芳香族碳氢化合物。酸性易离解的化合物容易在二氧化铝上形成死吸附。另外,氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。
3、 聚合物填料
聚合物基质受压会变形,压力限度低但pH使用范围宽。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强,使用任何流动相,在整个pH范围内稳定,可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强,但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。由于不耐压、有溶胀性,所以聚合物填料适宜用于大分子像蛋白质或合成的高聚物,另外还可以制成分子排阻、离子交换柱。近年发展迅速的大孔树脂,实际上主体就是苯乙烯-二乙烯苯聚合物或类似的合成高聚物。
由于硅胶基质的绝对地位,以下主要以硅胶为例。
二、形状大小粒度分布
基质要成为填料,首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有:薄壳型、无定形全多孔、球形全多孔,另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀,但涡流扩散大,渗透性差,比较难填装出稳定的柱床,一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小,渗透性好;如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话,具有传质阻抗小、载样量大的优点,柱效也更高。球形填料外形对称,比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量,因为填料粒度有一定分布范围,一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱压的关系为:柱效与填料大小成反比,柱压与填料大小的二次方成正比。所以,快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米长,就是为了降低柱压;需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。
色谱柱的安装:
(1)拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、 尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
(2)拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
(3)按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。
色谱柱的储存:
1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少,或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性);或在流动相中加20%的有机改性剂,也可抑制微生物生长,有机改性剂还有助于流动相脱气。
2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴比较好)中,避免在缓冲溶液中保存。
3.使用缓冲溶液后的色谱柱,应用15~20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱,后换成100%有机溶剂储存。
4.避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。
5.将色谱柱的两端用堵头拧好,以免柱床填料干裂。
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