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色谱柱的性能 色谱柱技术指标

时间:2020-08-31    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

色谱柱的性能

与液相色谱柱的性能相关的因素很多,基质(matrix)或者说担体、载体的化学性质、键合相(固定液)的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。
  色谱柱填料可以由基质直接构成,如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等;也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成,如:较为经典的各种ODS柱、氨基柱、氰基柱等。
一、基质的特点:
1、 硅胶
  硅胶是陶瓷性质的无机物基质,刚性大,不易变形。化学性质较稳定,但对于水溶液尤其碱性水溶液仍然是不稳定的,即使表面经过良好的化学键合,覆盖了固定液,还是要注意水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用,基质或者说是柱床(packed bed)溶解对色谱柱的影响是致命的。以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。纯硅胶填料适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物,硅胶也可以做凝胶色谱但柱效较低。硅胶基质键合固定相的高压液相填料,有其他填料无法比拟的高分离效能。
2、 二氧化铝
  二氧化铝和硅胶相似,但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。所以,极少用作键合固定相的基质,也是适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物,尤其是分离芳香族碳氢化合物。酸性易离解的化合物容易在二氧化铝上形成死吸附。另外,氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。
3、 聚合物填料
  聚合物基质受压会变形,压力限度低但pH使用范围宽。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强,使用任何流动相,在整个pH范围内稳定,可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强,但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。由于不耐压、有溶胀性,所以聚合物填料适宜用于大分子像蛋白质或合成的高聚物,另外还可以制成分子排阻、离子交换柱。近年发展迅速的大孔树脂,实际上主体就是苯乙烯-二乙烯苯聚合物或类似的合成高聚物。
  由于硅胶基质的绝对地位,以下主要以硅胶为例。
二、形状大小粒度分布
  基质要成为填料,首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有:薄壳型、无定形全多孔、球形全多孔,另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀,但涡流扩散大,渗透性差,比较难填装出稳定的柱床,一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小,渗透性好;如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话,具有传质阻抗小、载样量大的优点,柱效也更高。球形填料外形对称,比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量,因为填料粒度有一定分布范围,一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱压的关系为:柱效与填料大小成反比,柱压与填料大小的二次方成正比。所以,快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米长,就是为了降低柱压;需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。

 色谱柱使用前的注意事项  色谱柱在使用前,应进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。  但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的(出厂测试所使用的条件是较佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。  样品的前处理  a、使用流动相溶解样品。  b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。  c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。  流动相的配制  液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:  a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。条件进行  b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。  c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。  d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,应使用对紫外吸收较低的溶剂配制。  e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。  f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。  流动相流速的选择  因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求较佳柱效,较好使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。  当选用较佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。  注意:  1.由于甲醇廉价,对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。  2.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相,没有提纯的己烷不得使用。用水较好使用超纯水(电阻率大于18兆欧),去离子水及双蒸水中含有酚类杂质,有可能影响分析结果。  3.含水流动相在实验前配制,尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。应加入氮化钠,防止细菌生长。  4.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤,除去微粒杂质。  5.使用HPLC级溶剂配制流动相,使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命,提高柱性能。

色谱柱的安装

  (1)拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、 尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。

  (2)拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

  (3)按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。

色谱柱的储存:

  1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少,或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性);或在流动相中加20%的有机改性剂,也可抑制微生物生长,有机改性剂还有助于流动相脱气。

  2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴比较好)中,避免在缓冲溶液中保存。

  3.使用缓冲溶液后的色谱柱,应用15~20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱,后换成100%有机溶剂储存。

  4.避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。

  5.将色谱柱的两端用堵头拧好,以免柱床填料干裂。



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