高效液相色谱柱的故障分析 液相色谱如何操作

高效液相色谱柱的故障分析

色谱柱是有使用寿命的。一根正常的商品柱一般可以正常使用2000~5000次进样；保护良好的柱子可达10000次以上，但是有时候即使是一次不当使用就可能使柱子发生严重的损害。柱子受损害后，可表现为柱压升高、柱效下降、峰形异常等现象。

          1. 柱压升高

           造成柱压升高的可能原因有很多。一般是由于柱床内产生了异常的占位性物体，造成流体阻力加大所引起的。

          （1）流动相过滤不良        这往往是由于流动相没有过滤，或者虽然已经过滤但滤膜孔径过大或滤片损坏，使得固体杂质滞留于滤板上所造成的。致使柱的进口滤片处堵塞，压力升高。

          （2）霉菌生长      霉菌在流动相中、管路中或柱子进口处繁殖、生长，堵塞滤板，导致压力升高。这种现象在夏天，尤其是使用磷酸盐缓冲液为流动相时更易发生。在夏季使用磷酸盐缓冲液时一般要现配现用。即使保存在冰箱中，一般也不要超过两天。否则，即使不堵塞滤板，也会因细菌或霉菌孳生而产生的代谢物造成对样品的干扰。

          （3）非特异性吸附      当溶质在柱子上有较强的非特异性吸附，且当前所用的流动相难以将它们洗脱时，累积的未洗脱溶质也会造成阻力增大和压力升高。

          （4）更换流动相时置换不彻底      致使流动相不互溶

          （5）盐晶体的析出       更换流动相后，缓冲液在新的流动相体系溶解度低而析出

          （6）样品的沉淀      配制样品的溶剂与流动相不一致时，样品进入柱中溶解度可能降低而析出

          （7）压力脉冲      运行过程中，有时会产生系统内压力的突然升降。如，转动进样阀时动作过缓，造成液流堵塞再瞬间释放；开机瞬间压差较高等。压力脉冲会造成多孔填料的崩坏和柱床结构的微小变化。填料微屑的长期累积可能会使柱床阻力增大。

          2.  柱效下降

           柱子在使用过程中分离性能逐步降低是正常现象。但是如果发生突然降低或改变，属于异常现象。此时，应分析原因，有针对的采取措施，避免这种情况发生，或及时进行柱子再生，以求尽可能地恢复其性能。造成柱效下降的原因有很多，但最基本的原因是使用不当，造成填料特性或柱床结构的改变所致。

          （1）pH值  流动相的pH值是柱子使用中最需要注意的参数。以硅胶为基质的色谱填料通常仅适于在pH值2~8的范围内使用。过低过高的pH值都会造成填料配基脱落或基质的溶解。有时，仅仅是样品溶液的pH值影响，也会使柱子性能极大地破坏。

          （2）非特异性吸附 样品中强极性或具有强非特异性吸附的物质有可能吸附于填料表面，形成非特异性吸附层，改变柱子的表面活性，使分离性能发生变化，并使柱效降低。例如，有些植物色素经常会吸附于柱头，使柱子进口端颜色加深，整体柱效下降；有些蛋白质成分会在柱头变性而沉淀下来。

          （3）填料流失     制造不当的劣质滤板，以及上述的压力脉冲等

          （4）柱外效应   过长的连接管线、连接管线内径太大、过大的检测池体积、过大的进样体积等等，均会造成柱效下降。

          3.  峰形异常

           色谱的谱图是进行色谱分离分析时的基本结果和数据。在优化的条件下，色谱峰应是左右对称的高斯峰，彼此分离良好，且数据具有重复性。

          （1）分裂峰   分裂峰是峰顶端“分叉”，成为两个峰尖。出现这种情况时，往往所有的峰都发生分裂，而不是单独某一个峰分裂。分裂峰多是因为入口滤片上堵塞的固体杂质导致样品溶液流型改变而引起的。此外，柱入口端柱床塌陷和进样时进样阀切换动作不连续也会造成谱带流型分裂而形成分裂峰。

          （2）拖尾峰 拖尾峰多是由于硅胶表面残留的硅醇基和硅胶基质中的金属离子杂质对极性溶质的非特异性吸附而造成的。在使用过程中，pH值不当引起的配基脱落，非特异性吸附造成填料表面活性位点的损失及“新”活性位点的产生等填料表面性质的改变，均会形成拖尾峰。此外，过大的进样量会造成非线性吸附，性能已经改变的柱子导致相邻峰的不完全分离也会形成类似拖尾的峰。

          （3）无规杂峰    流动相中高保留杂质在填料上的累积和慢洗脱，流动相长霉产生的代谢产物，管路和进样阀等部件表面吸附的杂质的释放，前几次进样后没有洗脱的强保留峰在以后的进样时出的峰，以及样品分解与变质产生的物质等（如蛋白质样品降解为肽等），均可产生无规杂峰。另外，在进行梯度洗脱时溶剂和流动相中杂质浓集效应（低淋洗强度时吸附，高淋洗强度时洗脱出来）也属此类。

          （4）基线不稳  强保留杂质的慢解吸基线不断提高。 有时检测器和电路系统的不稳定也会引起基线的不稳。

          （5）倒峰   当柱子中有吸光度比流动相低的溶剂或低（无）光吸光性物质流出是，因光吸收值低于流动相，会表现为倒峰。

          4.  “烷基配基坍塌”现象

           在使用高比例水为流动相时，有时会出现所谓“烷基配基坍塌”的现象。这种现象的出现，主要是由于随着流动相中水比例的增高，流动相与硅胶的接触角迅速增大，导致流动相难以进入填料硅胶的细小孔中，也不能浸润孔内表面所致。这样必然会造成溶质在两项中分布情况的改变，产生保留时间减少、柱效降低、峰形变坏以及峰的拖尾等问题。

杭州森尼欧提供液相色谱仪色谱柱的选择指南

　　现代液相色谱仪色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。
一、硅胶基质填料：
1、正相色谱
　　正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其它具有极性官能团,如胺基团（NH2,APS）和氰基团（CN,CPS）的键合相填料。
　　由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份zui先被冲洗出色谱柱。
　　正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色谱
　　反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。
　　样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份zui先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。
　　常用的反相填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
　　 聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在pH值为1～14均可使用。
　　相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。
　　现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
三、其它无机填料
　　其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般于特殊的用途。如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体,又由于在HPLC流动相中不会被溶解, 这类柱可在任何pH与温度下使用。 氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在pH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是zui近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。
　　当然和气相色谱的原理一样，液相色谱的柱长度，柱内径对分离效果也有重要的影响。
　　您现在就可以看到其实液相色谱柱的分离效果主要取决于其色谱填料，柱长度，柱内径这几个因素，从原理上讲，这几个因素相同的柱子，其分离效果是完全一样的。
　　考虑到这一点，现在您完全根据这个更加本质的依据来现在您的液相色谱柱，而不必一定去现在昂贵的标准指定液相色谱柱。