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植物药分析中的薄层色谱 薄层色谱如何操作

时间:2020-08-31    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
 1前言

  传统薄层色谱法被广泛应用于药用植物的分析中,并作为植物药鉴别方法被世界上多数药典收录。薄层色谱一般方法学的描述通常并不详细,并给操作者留有太多的空间。因此用这种方法所得到的结果很值得考虑,有时甚至会难以判断。由于在薄层色谱中影响结果的许多参数被忽视,薄层色谱结果的重现性常常不能令人满意。这是阻碍任何方法现代化的巨大阻力。因此,出现了这样一种论调,认为薄层色谱是一种陈旧过时的技术,应该用更可靠的高效液相色谱或其它色谱技术代替它。

  但是大家不应忽视薄层色谱具有众多的优点。无论在植物药的鉴别,提取物和最后产品的稳定性测试,还是在生产过程中的进程控制,薄层色谱可将结果用一个图片表现出来的这个优点不可替代。快速的分析和每个样品分析的低成本也是它的优点。

  一个应用于新的药典各论的现代标准方法是让大家认识和接受薄层色谱是具有竞争力的现代分析方法的基本要求。这篇文章讨论了薄层的基本要素和实际工作中的要求,达到了这个最基本的目标。希望能促进这个建设性议题的讨论。

  2薄层色谱在药典中的现状

  在欧洲药典中,薄层色谱在所有的植物药、大多数提取物以及一些合成药物的各论中作为鉴别的基本手段。对于合成药物来说,似乎有一种趋势,在新增或修订的各论中不再使用薄层色谱作为有关物质检查的方法。

  虽然与其它药典相比,欧洲药典在薄层色谱的一般方法学部分具有较高的水平,但是仍没有反映在方法学方面的一些技巧以及当前技术所带来的好处。虽然规定只能使用预制薄层板,但是没有明确普通薄层板和高效薄层板之间的差别,也未说明哪种薄层板是。缺少薄层色谱一些重要实验细节(如薄层点样、薄层展开和衍生化)的指导性原则,甚至没有提到通过图象分析进行定性分析这一薄层较为重要的优点。虽然在一般方法学部分提到薄层色谱可作为定量方法,但是只有两个品种使用薄层色谱进行定量。所有的含量测定都使用高效液相色谱,甚至在鉴别中薄层色谱也被成功地用其它技术替代。如果采用现代薄层色谱技术,可以很容易地改变这种状况。

  3关于方法学改进的建议

 3.1、薄层板的材料和特性

  在70年代末期,Merck研制出了高效薄层板。它具有更小的粒度(5Ixm)和更窄的粒度分布范围(2—10μm)。与传统薄层板相比,高效薄层板具有更好的均一性,更平整的表面和更高的分离性能。

  假设药典原来用普通薄层板的方法以高效薄层板替代。我们就可以得到具有更好分离度,更少斑点扩散以及更好的板间重现性的结果。瑞士植物化学专业委员会已经在几个方法中确认了这个设想,并在欧洲药典注释中出版。

  虽然在各论中不能规定商品的品牌,但是也应引起注意,不同的生产厂家生产的薄层板即使通过了药典试剂章节要求的系统适应性试验,也会明显地影响到某一特定方法结果所得的重现性。

  因为很难设计一个实验对薄层板分离可能碰到的所有问题进行评价,在进行方法描述时应对薄层板的生产厂家进行规定,或者在方法中包含一个专门的效能测定实验(系统适应性实验)。这些工作已经要求作为各论的详细技术指导在研究方法时考察并提交给药典。然而似乎并没有规定在完成各论前的方法学考察中实际包含两种材料的薄层板,在方法的确认时也没有考察不同的薄层板材料,除非这些工作已经包含在各论中。这些都应该有一个大家可以接受的法定的要求。
 3.2、薄层点样将溶液中的样品转移到薄层板上有接触式和喷雾式两种点样方法。在点状点样时,样品溶液形成“环状色谱”,导致样品在点样原点上的不均匀分布。在展开后,斑点可能展宽或不均匀。当样品溶解于对其溶解性很强的溶剂中时,这种现象更为严重。
  采用喷雾点样方式可显著提高薄层系统的分离度和检出限。它也可将浓度低的样品以大体积点于薄层板上,同时不影响分离的质量。

  样品条带状点样,便于色谱的目视。如果这些条带是通过喷雾产生的,在整个条带上的样品的均一性又可得到进一步的提高。这是得到可靠的和可重复的定量分析结果的基础。应该注意,用一个接一个的小点点样所形成的条带或用所谓的浓缩带原点并不能得到那样好的分离度,其比移值小的斑点会受到干扰。

 3.3、展开

  薄层色谱的结果(斑点的位置、形状和分离度)依赖于展开缸的类型和饱和程度。因此一个方法只在特定的展开缸中以特定的方式展开才可具有重现性,如不进行调整,在其它系统中很难得到相同的结果。虽然常常使斑点较未饱和或双槽展开缸扩散大,但经典的饱和步骤(在展开缸或水平展开槽中)可获得可以的重现性。

  在薄层色谱的展开过程中,展开剂的移动速度不断减小。因为采用更小的粒子使薄层板更为紧密从而阻碍了展开剂的运动,高效薄层色谱板只能展开很短的距离。

  这些理论的推测可以很容易地用实验验证。例如甘菊油的高效硅胶薄层分离结果,当展开距离增加时,比移值0.4—0.5的两个斑点的分离度似乎有所增加。但是如果把这些色谱图放大到同一个刻度,两个斑点的相对位置似乎没有变化。分离度仍然在展开距离为6cm时最大。一般来说,随着展开距离的增大,比移值减小。这种现象可能是由于展开剂中的挥发性成分在薄层板上逐渐增加的所引起。同样刻度的相似曲线图也可得出与薄层图相似的结果。

  4结论

  基于理论和实践考虑,有必要对欧洲药典中关于薄层色谱一般方法学部分进行审议。在新增和修订药用植物各论时应包含有采用现代标准化方法学的薄层色谱鉴别。主要需考虑以下因素:

  ①薄层色谱方法一般应采用高效薄层板。

  ②为得到可以的定性定量分析结果,样品应采用喷雾点样,样品点应呈条带状。

  ③建议一般展开高效薄层板先预饱和,展开距离超过6cm。

  ④采用颜色反应以得到可见的薄层色谱结果的,应详细描述衍生化步骤。

  ⑤除采用描述方法外,还应用彩色图片以图籍的方式提供薄层结果。多个图象(如在紫外254nm,紫外366nm,可见光下的图象)有利于分析结果的判断。也应考虑

  【仪器网 使用手册】展开是薄层色谱法重要的步骤,展开剂与展开方式的选择都会对实验结果造成很大的影响。因此操作人员要根据实验要求与实际情况选择合适的展开剂与展开方式。
 
  展开剂
 
  展开剂的极性增大次序为:石油醚→环己烷→二硫化碳→四氯化碳→二氯乙烯→苯→二氯甲烷→氯仿→乙醚→四氢呋喃→乙酸乙酯→丙酮→丁酮→正丁醇→乙醇→甲醇→水→冰醋酸→吡啶→有机酸。
 
  展开剂的选择标准:选择展开剂时要求展开剂对薄层吸附剂有一定亲和力,能把被分离物从吸附剂表面解析下来,但又不能过强,否则被解析下来的物质不易再吸附。当单一溶剂不能满足要求时,可用多元混合溶剂作展开剂。
 
  展开方式
 
  1.上行展开
 
  点样后的纸或薄层的底边置于盛有展开剂的直立型的多种规格的平底或双槽展开室中,展开剂由纸或薄层下端借毛细管作用上升至前沿。适合含粘合剂的硬板展开,是薄层色谱中常用的展开方式。
 
  2.下行展开
 
  将点样后的滤纸悬放在展开剂槽中,用粗玻棒压纸以固定,展开室底部可放饱和滤纸用的溶剂,展开剂从上而下流动,下行法中展开剂除毛细管作用外还有重力作用,因此展速比上行法相对较快,多用于纸色谱法。
 
  3.双向展开
 
  一般操作是取一块方形的薄板,在角上点样,展开后取出晾干。将薄板转90度,换另一种展开剂再次展开,可取得较好的分离效果。通常用于成分较多、性质比较接近的难分离物质的分离。
 
  4.近水平展开
 
  将适量展开剂倾入长方形的玻璃展开室中,将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.5cm,薄层上端垫高使薄层与水平成5°-10°的角度,这样展开剂就由下而上进行展开。这种展开方法适用于不含粘合剂的软板的展开。   【仪器网 使用手册】薄层色谱有好几种类型,实验时使用的器材也有不同的材料可以选择。使用薄层色谱进行分析时,需要根据目标物质选择合适的实验器材,才能更好地进行实验,保证结果准确。
 
  背衬板
 
  背衬板的材料一般有三种:玻璃、铝和塑料。玻璃板具有高耐化学性和良好的热稳定性,可重复使用,适用于炭化,是常用的背衬。但是非常容易破损,而且不能轻易切割成所需尺寸,厚度>1.0 mm比铝板或塑料背板要厚很多。
 
  铝箔板易于操作且抗破损,比玻璃板轻薄,可降低运输成本,节省仓储空间,还可以很容易地用剪刀剪成所需尺寸。铝箔板具有强吸附层附着力,适用于含有高浓度水的洗脱液。但是不能重复使用,而且对于诸如无机酸和浓氨的试剂而言,不如玻璃具有耐化学性。
 
  塑料或聚酯 (PET) 板背衬也轻便且灵活。与铝箔板一样,它们可以切割成所需尺寸并存储在实验室笔记本中以备将来参考。它们还具有很好的耐溶剂性能。但是塑料板热稳定性低,炭化必须在比玻璃更低的温度下进行,而且柔性吸附层可能更容易开裂。
 
  吸附层/基质
 
  硅胶:微酸性极性固定相,适用于酸性、中性物质分离。常见的薄层色谱吸附剂,不具有氧化铝的催化性能。
 
  氧化铝:碱性极性固定相,适用于碱性、中性物质分离
 
  纤维素:含有羟基的极性固定相,适用于分类亲水性物质。可以是微晶纤维素或纤维纤维素。当在微晶纤维素层上分离时,斑点通常比在纤维纤维素层上分离时更紧凑。
 
  聚酰胺:含有酰胺基极性固定相,适用于酚类、醇类化合物的分离。具有低扩散性,允许具有大强度的严格限制的样品点。不推荐使用腐蚀性显影试剂。
 
  粘合剂
 
  聚合物(有机)粘合剂:含有聚合物粘合剂的吸附层板通常坚固,使样品处理和应用更容易。它们还允许在显影溶剂中使用更高的水含量。适用于所有薄层色谱应用(使用炭化进行可视化的应用除外)。
 
  无机粘合剂:比没有粘合剂或石膏粘合剂的吸附层板更坚固,耐水的并且与水性显影剂相容。通常用于制备型薄层色谱板,对于需要炭化以便可视化的应用,或开发或可视化试剂与有机粘合剂相互作用时,推荐使用带有无机粘合剂的板。
 
  石膏:容易断裂,不建议将它们用于含有超过20%水的显影溶剂。但是允许含有目标分子的斑点容易地从洗脱和回收支持物上刮下,推荐用于需要炭化以便可视化的应用。

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