高效液相色谱仪操作三要点 液相色谱如何操作

高效液相色谱仪操作三要点

高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样，你若想让HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，较为重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。

一、脱气

      流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC系统内是不希望有气泡存在的。HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。

       当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。

      紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。

       所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE管）渗透进流动相中。

       如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种：

1. 吹氦脱气法。利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa压力下，以约60 mL/min流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。

2. 加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。

3. 抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。

4. 超声波脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡10～20min。此法的脱气效果最差。

5. 在线脱气法。现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。建议购买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。

二、过滤

         任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。在HPLC系统中，颗粒物的主要来源有三个途径：流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。

1、流动相

        如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 µm微孔滤膜过滤。同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2 µm微孔滤膜。然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗粒。在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中成为残渣。

       流动相通过0.45 µm微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效方法。0.2 µm微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45µm微孔滤膜更有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的质量不太好时。建议实验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验室的规定，即：

        流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使用前必须过滤。

        在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。这个过滤器的规格为≥10 µm的微孔物质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。

安捷伦液相色谱仪常见问题及相应的解决方法：

一、安捷伦液相色谱仪常见问题——柱压高

    原因分析以及解决办法：

（1）缓冲液盐分如（乙酸铵等）沉积于柱内。先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下 降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟。

（2）样品污染沉积。由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，换成甲醇冲洗，接着用甲 醇+异丙醇（4+6）冲洗柱子，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，zui后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。

二、安捷伦液相色谱仪常见问题——不稳定

    原因分析以及解决办法：

原因：系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。

解决办法：处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。

三、安捷伦液相色谱仪常见问题——指示

    原因分析以及解决办法：

（1）泵密封垫圈磨损。更换密封垫圈          

（2）大量气泡进入泵体。在泵作用的同时，用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。

四、安捷伦液相色谱仪常见问题—— 重复性差

    原因分析以及解决办法：

（1）进样阀漏液。更换进样阀垫圈

（2）加样针不到位。保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态 转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。

（3）液量不足。

五、安捷伦液相色谱仪常见问题——峰分叉

 原因分析以及解决办法：

（1）色谱柱被污染。先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇（4+6）冲洗柱子（冲洗时间的 长短由样品污染的情况而定），再换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，zui后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。

（2）柱头填料塌陷。拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分（污染的填料），装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈 钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。