色谱柱在色谱仪分析系统中起着分离作用,是色谱分析的核心部件。正确使用和维护色谱柱尤为重要,使用不当就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。以下从几个方面简单介绍液相色谱柱在使用过程中应当着重注意的问题。
一、避免压力和温度的急剧变化
温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,以保持色谱柱内填料的稳定性。
二、避免直接改变溶剂的组成
在需要改变检测样品溶液组成是,应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。且在使用次洗脱能力强的洗脱液冲洗色谱柱时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右,即常规分析需要50~75ml。
三、避免色谱柱反冲
一般来说色谱柱不能反冲,只有色谱柱使用说明书上标明该柱可反冲才可以反冲除去留在柱头上的杂质。否则,反冲色谱柱的影响是迅速降低柱效。
四、避免流动相使用不当而破坏固定相
选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一段预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和",避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
五、禁止样品未经处理直接进入色谱柱
避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
六、禁止将缓冲溶液长时间存放在色谱柱内
保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
七、禁止色谱柱未经处理直接封存
色谱柱使用完成之后须使用相宜溶剂进行清洁处理,例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡;当采用盐缓冲溶液作流动相时,使用完后应用无盐流动相冲洗;含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道,不宜长期与之接触;装在液相色谱仪上的色谱柱如不经常使用,应每隔4-5天开机冲洗15分钟。
在日常分析工作中,色谱柱的正确使用和维护十分重要,色谱柱使用是否得当,直接影响色谱柱的寿命,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。
1、柱子在装卸、更换时,动作要轻,接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动,以免柱床产生空隙。
2、如果仪器用来做常规分析,样品种类不多,但分析次数比较多,则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱,这样有助于延长柱子的寿命。
3、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会对柱内填料产生冲击力,因此在调节流速时应该缓慢进行,手动进样时,进样阀的转动不能过缓。
4、应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。
5、使用柱温箱时,应注意在流动相进入色谱柱后才能开启柱温箱升温。
6、一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
7、选择使用适宜的流动相,以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
8、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
9、经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。
10、保存色谱柱时应将柱内充满色谱级的乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置一个晚上或更长时间。
11、色谱柱使用过程中,如果压力升高,一种可能是烧结滤片被堵塞,这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进人柱内,使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形,则可能柱头出现塌陷,死体积增大。
12、在完成分离分析工作之后,不应立即停机,需及时对色谱分析系统进行冲洗,一般30分钟以上,以除去色谱柱内的杂质。
在液相色谱分离系统中,色谱填料选择的正确与否会直接影响到专业的液相色谱柱分离物质效果的好坏。由于液相色谱填料具有相当宽的选择范围,所以我们在购买液相色谱柱之前有必要对不同液相色谱填料进行一个简单的认识和了解。
第一、正相色谱硅胶基质填料。
正相色谱柱的固定相是由硅胶和其他具有极性官能团组成的键合相填料。其物质分离特点是极性较弱组合最先被色谱柱冲洗出来。而且正相色谱所使用的流动相其极性要低于固定相,流动相通常使用正乙烷和二氯甲烷等。
第二、反相色谱硅胶基质填料。
反向色谱柱的填料是以硅胶材料为主要物质,并与极性相对较弱的官能团组成的键合相。其物质分离特点是极性较强组合最先被色谱柱冲洗出来,而极性弱的组分则会更强的保留在柱子上。反向色谱的流动相的极性相对较强,常配制有机缓冲液作为流动相。目前较为常用的反相色谱填料有C4(B)、C8(MOS)以及C18(ODS)等。
第三、聚合物填料。
这种聚合物的填料一般是由聚甲基丙酸酯或者聚苯乙烯-二乙烯基苯组成。其特点是这种色谱柱的酸碱度适用范围相对较广,且疏水性很强,但它的柱效相对于硅胶基质的填料要低一些。一般将这种大孔的基质填料用于蛋白质的分离。
第四、其他无机填料。
如石墨化碳对于酸碱度和温度没用严格的限制范围,一般可对一些几何导构体进行分离。此外还有氧化铝以及氧化锆等无机填料的应用。
总而言之,如果我们能够全面系统的了解一下液相色谱柱填料的分类及特点,那么我们在选择购买一流的色谱柱时就可以在一个相对较小的范围内顺利找到自己所需要的产品。这样我们就可以在节省选择购买时间的同时,也能快速买到令自己满意的色谱柱。
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