通用型反相色谱柱在使用前,进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要留意: 液相色谱柱柱性能可能由于所使用的样品、活动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是zui佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。
样品的前处理:
a、使用活动相溶解样品。
b、使用予处理柱除往样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除往微粒杂质。
通用型反相色谱柱的保养
通用型反相色谱柱在使用前,进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为评价柱性能变化的参考。
但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是zui佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。在对色谱柱使用前进行测试以后,要根据不同的情况对色谱柱进行保养:
①通用型反相色谱柱每天实验后的保养:使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。
注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。
②长期保存色谱柱:如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中,离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度是室温。
色谱柱是色谱仪器中重要组成部分之一,它是分离不可缺少的一部分。因此不同的样品分类,用到不同的色谱柱。
色谱柱可简单分为以下几类:
a、根据分离方式分为:
(1)正相色谱柱:SIL--磷脂、NH--糖、维生素E,CN--甾类激素。
(2)反相色谱柱:ODS(C18)、(C8CNTMSPheny1)低分子量化合物。
(3)离子交换色谱柱等。
b、根据所有的担体材料分为三种:
(1)硅胶型:机械强度高,易制成小颗粒,理论塔板数高。
(2)聚合物型:在广泛的PH值范围内稳定。
(3)羟基磷灰石型:对蛋白质等生物高分子样品有特殊的选择性。
一﹑去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板,筛板被堵住不仅会引起柱压的升高,而且也会引起柱效下降,因为筛板的堵塞会引起液流不均,导致色谱峰型拖尾、变宽,从而使柱效下降。因此,建议使用超纯水和色谱纯试剂,在分析样品前对样品进行针筒过滤,流动相过0.45μm滤膜。
二﹑流动相的PH应在使用的范围内
由于流动相的PH 控制不当而对色谱柱造成的损害,通常很难使色谱柱恢复,因此必须认真对待,严格控制流动相的PH值。
三、使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质,因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质,这些固体颗粒被流动相带入色谱柱,堵塞筛板,导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板,其孔径与色谱柱孔径相同,因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱,有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例,因此,除对样品和流动相进行过滤外,建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
如果色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的,可选择一下方式进行补救:
1、先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器,然后用甲醇、水=20/80ml/min反向冲色谱柱180min。
2、先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器,然后反向使用。
四﹑防止强保留物质在色谱柱上存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积,对样品中的化合物产生额外的保留行为,不仅引起峰型变宽、拖尾,使柱效下降,同时也会引起保留时间的变化,累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应,需要一定的时间才会体现出来,但对许多药品特别是复杂样品而言,很难判断其是否是含有强保留物质,因此要防止强保留物质的累积,需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙氰清洗色谱柱。
五﹑正确使用缓冲盐
缓冲盐通常易溶于水,难溶于有机溶剂,因此缓冲盐使用不当会使其析出,堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙,使填料板结,柱压上升;同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展,使色谱柱的保留能力下降,柱效降低。缓冲盐析出后,去除非常困难,因此,正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
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