液相色谱流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中。因为许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料中的增塑剂,导致溶剂被污染。被污染的溶剂如用于液相色谱系统,可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成的变化,同时防止空气中的氧和二氧化碳溶入流动相中。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液极易长霉,应尽量新鲜配制使用。如需贮存,可至于冰箱内冷藏,并且一般不要超过3天。
卤代溶剂中可能含有微量的酸性杂质,能与液相色谱仪系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解,不能存放太久。卤代溶剂混合后,可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的化合物。因此,尽量不采用卤代溶剂的混合流动相,或者使用之前新鲜配制。
此外,卤代溶剂与一些反应性有机溶剂(如乙腈)混合静置时,还可能产生结晶。
贮液器是装预混合流动相或流动相组分的容器,构造相对简单,但用于不合适的贮液器也可能带来问题。贮液器被污染了可能阻塞烧结不锈钢过滤片,影响液相色谱仪泵性能,在色谱图种出现多余的峰或者产生噪声。
贮液器的容积一般为1L,有的贮液器仅能用于冲氦气,而不能用于真空脱气,因为有破裂的危险。用于真空脱气的贮液器要加厚或者加外套。自备的贮液器要松松地盖上盖子,以挡灰尘。盖得太紧会形成部分真空,使泵停止运转。
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每天用足够的时间来维护色谱柱,您将节省更多用于处理色谱柱故障的时间,同时您的色谱柱的寿命也会变得更长!色谱柱的使用寿命,除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关外,主要的是与日常的维护密切相关。色谱柱的使用寿命主要是根据柱效和柱压两个指标来衡量,如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高,通常被认为该色谱柱的使用寿命已经结束。因此,延长色谱柱使用寿命的关键是,消除引起柱效下降和柱压升高的因素。通过以下几点帮助您完成色谱柱的日常维护工作。
流动相的pH 值
由于硅胶基质的填料中存在Si-C和Si-O键,流动相超过其pH范围将会导致硅胶基质溶解和键合相碳链断裂,使柱效下降,寿命变短。由于流动相的pH控制不当而对色谱柱造成的损害,通常很难使色谱柱恢复,因此必须认真对待,严格控制流动相的pH值。。
去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板,筛板被堵不仅会引起柱压升高,而且也会引起柱效下降,因为筛板的堵塞会引起液流不均,导致色谱峰形拖尾、变宽,甚至出现双峰,从而使柱效下降。因此,建议使用超纯水和色谱纯试剂,在分析前对样品进行超声、针筒过滤,流动相过0.45µm 滤膜,尤其是流动相加入了缓冲盐(如NaH2PO4等),必须过滤。
博纳艾杰尔为您提供了一系列高质量的过滤产品,外壳采用聚丙烯材料,滤膜为意大利进口。种类有:混合纤维素(MCM)、尼龙(Nylon)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、 聚醚砜(PES)、增强型纤维素膜(Reg. Cellulose)、玻璃纤维、PP等,常用规格为:直径13mm、25mm、33mm;孔径:0.45µm、0.22µm等。
使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质,因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物,这些固体颗粒被流动相带入色谱柱,堵塞筛板,导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板,其孔径与色谱柱筛板孔径相同,因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱,有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例,因此,除对样品和流动相进行过滤外,建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
正确使用缓冲盐
缓冲液可以提供离子平衡的反离子,并使流动相保持一定的离子强度和p H 值,减少拖尾。缓冲盐通常易溶于水,难溶于有机溶剂,因此缓冲盐使用不当会致其析出,堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙,使填料板结,柱压上升;同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展,使色谱柱的保留能力下降,柱效降低。缓冲盐析出后,去除非常困难,因此,正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出,因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话:使用前要过渡,使用后要冲洗。
具体方法如下:
a . 等度条件:使用缓冲盐前用过渡流动相以1.0mL/min 流速冲洗20-30倍柱体积,然后再使用含有缓冲盐的流动相;使用后去除缓冲盐的方法是用过度流动相以1.0mL/min流速冲洗30倍柱体积,然后以纯有机溶液冲洗30倍柱体积保存。
b .梯度条件:用含有缓冲盐的流动相进行梯度洗脱之前,用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0mL/min流速冲洗30倍柱体积,再开始梯度的运行;分析完成后,再用过渡流动相以1.0mL/min冲洗色谱柱30倍柱体积,然后以纯有机溶液冲洗30倍柱体积保存。
另外,在使用缓冲液的过程中还要注意以下几点:
a .避免使用盐酸盐,盐酸盐对钢质有腐蚀作用;
b .缓冲液需现配现用,往往缓冲液是良好的菌类培养液,隔天或放置长时间实验时会发生很多怪现象;
c .使用缓冲液要及时掌握pH范围,做到胸中有数;
d .清洗液路和柱子时,有温控可加热到30摄氏度易于冲洗;
e.长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出,若有白色盐类析出,定期用10%硝酸冲洗液路(拆下柱子,冲洗30mL10%硝酸溶液,再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞;
f.选择缓冲液要用可靠的试剂,避免不纯的盐类造成不必要的麻烦;
过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同,但是不含缓冲盐的溶液。
防止强保留物质在色谱柱中存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积,对样品中的化合物产生额外的保留行为,不仅引起峰形变宽、拖尾,使柱效下降,同时也会引起保留时间的变化,累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应,需要一定的时间才会体现出来,但对许多样品特别是复杂样品而言,很难判断其是否含有强保留物质,因此要防止强保留物质的累积,需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙腈30倍柱体积清洗色谱柱。
色谱柱的再生
a、反相柱
以下列溶剂顺序冲洗30倍柱体积
乙腈-水(5:95) → THF → 乙腈-水(5:95)
b、正相柱
以下列溶剂顺序冲洗30倍柱体积
正己烷 → 二氯甲烷 → 异丙醇 → 二氯甲烷 → 流动相
c、硅胶柱(Si)除水
30mL 2.5% 2,2 二甲氧基丙烷和2.5%冰醋酸正己烷溶液冲洗柱子
液相色谱仪的密封圈更换是所有液相色谱分析人员都必须学会的方法。各类型的检测仪器有不同的操作方法,可以参照各自的使用手册,简要介绍如下。
第一、准备好工具和所需部件。工具包括扳手、超声清洗器、密封圈安静工具、新密封圈。用水-甲醇冲洗泵,拆开进出口管道,在泵头和单向阀上标出液流方向。
第二、将柱塞杆缩至最小,松开泵头的收紧螺钉,小心托住泵头。操作时要注意处处以平衡的动作慢慢退出泵头,切不可摇动或上下左右摆动泵头。
第三、从密封圈孔中轻轻拔出旧密封圈,注意不要化泵头内壁,要毫不犹豫地随即扔掉旧密封圈。
第四、将泵头和新密封圈分别放入甲醇中超声清洗,同时用无纤维纸擦洗柱塞杆。察看柱塞杆上有无划痕,如有划痕应换新柱塞杆然后再安装密封圈,
第五、安装新密封圈。这一步要用专门的安装工具,切不可粗心大意,避免损坏密封圈。
第六、重新装上泵头。先在柱塞杆上滴几滴甲醇以湿润,滑动泵头到位。千万不能摇动或摆动,以防柱塞杆在这一步操作时折断。平衡地上紧固定螺丝,接上进液管道。
最后、打脱气甲醇到泵腔中,不断用纸巾从泵出口处吸去流出的液体,等到无气泡一处再接上输出管道,打开放空阀,继续抽20mL甲醇赶走气泡后,换成需要使用的流动相。
液相色谱仪密封圈也叫HPLC密封圈,是由聚合材料密封壳和耐腐蚀的不锈钢金属弹簧组成。
密封圈安装在沟槽内,弹簧受压,形成向外的张力,促使密封唇紧贴密封沟槽,由于弹簧永久给密封唇提供弹力,能弥补密封壳磨损和配合零件的偏心,由此形成从真空到低压范围内的密封。
另外系统压力会辅助弹簧蓄能,压力越大,密封唇与沟槽贴合的越充分,由此形成高压密封。
密封外壳材质是由PTFE、填充PTFE、PEEK、填充PEEK、PVDF、PPS或其它高性能的聚合材料经机械加工制成,材料决定了弹簧蓄能密封圈适用于从-200℃到+300℃温度范围内,密封几乎所有的液体、化学制品和气体。并且可以无限贮存,不存在老化问题。
金属弹簧有多种形式可供选择,满足不同运动形式的密封要求。
在有些场合可由不同材质的O形圈替代金属弹簧做为弹性体使用。