高效液相色谱法测定连翘中连翘苷的含量
连翘系木樨科植物连翘Forsythiae suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果实。按采收时期不同，分青翘、老翘［1］两种。连翘为传统常用中药，含有大量的木脂素类［2～4］成分，测定方法虽有一些报道［5，6］，但无法定检验方法。本文建立了HPLC法测定连翘的有效成分之一连翘苷的含量，经过大量试验，优化了提取分离方法及色谱测定条件，方法学考察表明，该法简便易行，重现性好。
1 仪器与试药
岛津LC—6A输液泵，SPD—6AV检测器，C—R3A数字处理机；岛津LC—10AD输液泵，SPD—10A二极管阵列检测器，CLASS—10A色谱工作站；连翘苷对照品：中国药品生物制品检定所；连翘药材：山西省药检所提供及河北安国药市购买，由中国药品生物制品检定所中药室鉴定。甲醇、乙腈等试剂均为分析纯。
2 色谱条件
色谱柱：Axxiom-ODS(4.6mm×25cm)；检测波长：280nm；流动相：乙腈—水(25∶75)；流速：0.8mL/min。理论板数以连翘苷计为5000。样品分离色谱图见图1。
3 色谱峰紫外光谱一致性比较
样品中所测成分色谱峰与连翘苷对照品色谱峰200～400nm紫外光谱比较，相似度(Similarity)为1.00(见图2)。
4 溶液的制备
4.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥48h的连翘苷对照品适量，加甲醇制成0.25mg/mL的溶液。
图1 对照品(A)与样品(B)HPLC色谱图
1.连翘苷
图2 样品测定成分与对照品色谱峰紫外光谱
1.连翘苷 2.样品
4.2 供试品溶液的制备 精密称取连翘粉末约1g，精密加入甲醇15mL，密塞，称定重量，冷浸过夜。超声处理25min，放至室温，补足失重，滤过。精密吸取续滤液5mL，水浴蒸至约0.5mL，加中性氧化铝0.5g拌样后，蒸干，加于已处理好的中性氧化铝柱(100～120目，1g，内径10～15mm)上，用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并转入5mL量瓶中，定容，摇匀，过0.5μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。
5 线性关系的考察
分别配制连翘苷对照品浓度为0.098、0.197、0.288、0.393、0.501mg/mL的甲醇溶液，各精密吸取5μL注入液相色谱仪，测定。以连翘苷进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算回归方程为：
Y＝91239.1X-1054.9 r＝0.9995
结果表明：连翘苷在0.5～2.5μg范围内线性关系良好。
6 精密度与重复性试验
精密吸取对照品溶液6μL，重复进样6次，测得平均峰面积积分值为136648，RSD为0.4%，n=6；按供试品溶液制备方法处理同一批样品5份，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，进样测定，以外标法计算，结果连翘苷平均含量为4.23mg/g，RSD为1.8%，n=5。
7 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品5份，每份0.5g，分别精密加入0.4164mg/mL连翘苷对照品甲醇溶液5mL，精密加入甲醇10mL，按与供试品溶液制备相同的方法进行处理，同项“6”法进样测定、计算，结果平均回收率为99.53%，RSD=1.06%(n=5)。
8 样品测定
取不同来源的连翘药材，按供试品溶液制备方法处理，同项“6”方法进样测定，计算，结果见表1。
表1 样品测定结果
来源
含量(mg/g)
青翘
安国药市1
2.30
安国药市2
5.25
山西沁源
4.23
老翘
山西安泽
0.15
河南洛阳
1.59
安国药市
1.64
全屏显示表格9 讨论
9.1 样品制备曾采用加水沉淀法，以去除其它成分的干扰，但结果不甚理想，采用吸附柱层析法则大大提高了供试品溶液的纯净度。通过对氧化铝、氧化镁、大孔吸附树脂等柱的净化效果的比较，从中筛选出中性氧化铝柱；经对不同浓度的甲醇、乙醇溶液的洗脱效果作比较，结果以70%乙醇溶液为较佳。
9.2 曾选用甲醇—水(35∶65)、加入少量四氢呋喃作流动相，结果峰形不甚理想，采用乙腈—水后可有效地改善峰形，而且乙腈浓度的变化可明显影响连翘苷的保留时间。
9.3 样品测定结果表明：不同来源的连翘药材的连翘苷含量相差较大，而青翘中的连翘苷含量相对较高。
参考文献
1 中国药典.1995.一部：145
2 林启寿.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977.115，345
3 千叶真理子等.汉药レンギョウの成分研究(第3报)シナレンギョウおよびレンギョウ果实の成分について，生药学杂药学1978，32(3)：194
4 西部三省等.汉方药レンギョウの成分研究(第2报).第九改正日本药局方レンギョウ基原植物の果实におけるリグナン配糖体成分の比较，药学杂志，1977，97(10)：1134
5 梁文藻等.连翘成分分析Ⅰ.连翘甙和连翘脂素的分离鉴定和测定.药物分析杂志，1985，5(1)：1
6 崔燕岩等.连翘有效成分的HPLC法测定.药学学报，1992，27(8)：603
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高效液相色谱仪色谱柱在色谱分析系统中主要起着分离检测物质的作用，如同色谱系统的心脏，同时也是易损耗品。什么情况下会导致液相色谱柱柱效降低甚至“失效”。
1、筛板堵塞
色谱柱入口筛板堵塞是较为常见的问题之一，会导致柱压升高、色谱峰拖尾、塔板数降低等问题。通常分析样品中微粒杂质最右可能堵塞色谱柱入口，因此分析时，需要先过滤或者离心，乳浊或浑浊样品应以0.25?m滤膜处理，也可用针头过滤器过滤。进样器与泵密封垫的磨损也会带入微粒，在进样阀与色谱柱之间使用0.25?m或0.45?m的在线过滤器，通常可以避免这类问题
2、强保留样品组分
强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地影响色谱柱寿命。像生物组织或体液的提取物、天然产物等复杂样品，极易造成柱头的污染。相对较纯的样品，一般不会出现这一问题。色谱柱应用中，色谱峰严重拖尾或分裂往往是强保留污染物在柱头吸附的体现。
3、色谱柱装填不良
装填不良的色谱柱，在短时间应用后，填充床的压缩通常使柱头处产生塌陷，导致柱效突然降低。色谱柱的初始评价指标，如塔板数、不对称因子等往往不能很好地表征色谱柱床层的稳定性，这种情绪只能在实际应用中发现。
4、压力因素
液相色谱仪色谱柱使用过程中的骤然压力波动、机械撞击或温度骤然变化都会对色谱柱床层产生影响，导致峰形变差和柱效降低。进样过程中，进样阀转动太慢可引起压力波动，使色谱柱床产生裂隙，在柱切换时也存在同样的问题。使用填充良好的色谱柱，在较低柱压下操作，可大大减少由压力波动造成的色谱柱损坏。
有些色谱柱厂家建议在使用液相色谱柱时加入保护柱，保护柱是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命。
柱子的再生
色谱柱属于色谱分析的常用消耗品，它是有寿命的；但它寿命的长短与我们的样品处理程度、有无加保护柱以及清洗是否恰当和彻底紧密相关！当柱子在使用一段时间以后，它的柱压可能升高，柱效可能降低，这时如果我们对柱子进行再生，它的寿命也许会得到一定的延长。
柱子使用
1、首先要确认您所要分析的样品流动相的pH范围是否在您的柱子的pH范围之内，以免损坏柱子硅胶！
2、接下来就是用你做样品的流动相去平衡柱子，如果您的流动相中含有缓冲盐溶液，在平衡柱子之前务必要先用5％的甲醇(乙腈)/水去过渡10倍柱体积(150x4.6mm柱子约为30ml，250x4.6mm柱子约为45ml；下同)以上，再用带盐的流动相去平衡柱子足够的时间(直到基线非常平稳为止)，之后方可进样分析。
3、无论您分析何种样品，都会由于各种原因样品中总有部分杂质，因此建议您在进样前在柱子前端加接保护柱以保护您那昂贵的分析柱，或者用0.2um或 0.45um针头过滤器过滤样品后方进样分析！
1 高效液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法
高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
1.柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。
压力过高：这是高效液相在使用中常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。
(1) .首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；
(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查；
(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
压力过低：压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
2.漂移问题 主要包括基线漂移和保留时间漂移。
2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：
1、柱温波动。解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流通池被污染或有气体。 解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最hao断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。
3、紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯
4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
5、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
6、检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调整至最大吸收波长处
7、流动相的PH值没有调节好。解决方法：加适量的酸或碱调至最haoPH值
二、.
保留时间漂移保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：
1、温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障
3、色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
4、流速变化。解决方法：重新设定流速
5、泵中有气泡。解决方法：、从泵中除去气泡
2.3 峰型异常问题 峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。
1、色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。
2、 一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。
3、 所有峰均为负峰。解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。 、
5、所出峰比预想的小。解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。
8、拖尾峰。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。
9、出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。
3 结语
以上内容只是对液相色谱中出现的常见的问题进行了分析，在故障排除时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系；如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费；这是成功进行故障排除的关键。总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养。
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