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液相色谱仪出峰异常解决方法 液相色谱如何做好保养

时间:2020-08-31    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

液相色谱仪出峰异常解决方法

诊状
(一)保留时间变化
可能的原因 : 解 决 方 法
1.柱温变化 : 柱恒温
2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 : 用>25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 : 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 : 采用保护柱

(二)保留时间缩短
可能的原因 : 解 决 方 法
1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 : 降低样品量
3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 : 柱恒温

(三)保留时间延长
可能的原因 : 解 决 方 法
1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度降低 : 柱恒温

(四)出现肩峰或分叉
可能的原因 : 解 决 方 法
1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 : 更换进样器转子

(五)鬼峰
可能的原因 : 解 决 方 法
1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 : 处理样品
3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水
(六)基线噪声
可能的原因 : 解 决 方 法
1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压

(七)峰拖尾
可能的原因 : 解 决 方 法
1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

(八)峰展宽
可能的原因 : 解 决 方 法

1.进样体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载 : 进小浓度小体积样品
 

  一套液相色谱系统大致分为以下几个部分:流动相前处理部分、输液部分、进样部分、分离部分、检测部分。
 
  一、流动相前处理
 
  流动相前处理主要包括过滤和脱气,使用设备主要为溶剂过滤器、真空泵和超声波。
 
  1、过滤。HPLC所用流动相必须预先过滤和脱气,过滤的作用是防止颗粒性的杂质堵塞系统,或影响单向阀的正常工作。过滤时需要注意滤膜的选择,油膜和水系膜必须分开使用。水膜易有机溶剂溶解而进入系统导致泵流路和色谱柱头的堵塞。
 
  2、超声。超声的作用是去除流动相中的气泡。超声时间一般在20min即可。超声后,液体温度会升高,应冷却到室温再使用。超声后的流动相若需隔天使用再次超声。
 
  二、输液系统
 
  输液系统即是指高压恒流泵,其作用是能提供稳定准确的流速。
 
  1、溶剂过滤头。吸液过滤头,或称沉子,主要作用是过滤流动相中可能存在的颗粒性杂质。长时间使用后,杂质有可能阻塞溶剂过滤头上的过滤板孔隙;或长时间使用缓冲液,过滤头表面容易产生一层膜,阻碍流动相正常通过。严重时,即使是已超声过的溶剂,泵吸液时也会有气泡在四氟输液管里产生,因此应经常对过滤头进行清洗。清洗溶剂可以选择乙醇或者30%稀硝酸溶液,正相系统需注意滤头的烘干处理。
 
  2、单向阀。单向阀的作用是确保液体向一个方向流动,是高压恒流泵稳定输液的保证。日常使用过程中,可以通过观察压力的情况,初步判断流量是否正常。如果系统已经平衡一段时间,压力应该是稳定的。但如果压力存在波动,则表明流量不稳定;如果无压力,则表明无流量。这两种情况大多是因为单向阀里混入了气泡或杂质。混入气泡的情况,应把放空阀打开,按冲洗键将里面的气泡排出。单向阀混入杂质的情况,须对其进行清洗。清洗溶剂可以选择乙醇,安装时注意标记环的方向。 单向阀装配图及剖面图 1 带标记环阀外套;2 陶瓷座;3 宝石球;4 带密封垫限位套;5 密封垫
 
  3、密封圈。密封圈是固定在柱塞杆上防止泵腔内的液体泄漏,是保证泵头输液正常的关键部件。但柱塞杆和柱塞密封圈长期使用会发生磨损,主要与流量、操作压力和所使用的流动相有关。当使用含盐的流动相时,由于脱水或蒸发,可能形成盐结晶,而泵运动时盐结晶会导致密封圈和柱塞杆的磨损。因此,每天实验前和实验后都需用纯水冲洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二级密封圈之间),保持清洗管内有水以防止形成晶体,延长柱塞杆和密封圈的使用寿命。 等度系统 梯度系统 柱塞杆清洗连接示意图
 
  4、在线过滤器。为了防止由于流动相杂质微粒进入色谱系统,泵在放空阀内安装了在线过滤器,经泵出口流出的液体通过在线过滤器,经排空管流出的液体不通过在线过滤器。仪器使用一定时间后,建议用户清洗在线过滤器的烧结不锈钢过滤片。用扳手卸下压帽,将密封环和烧结不锈钢过滤片一同取出清洗,清洗后按原位装上。清洗溶剂可以选择30%稀硝酸溶液,正相系统需注意滤头的烘干处理。
 
  三、进样系统
 
  进样系统分为手动进样阀和自动进样器。
 
  1、手动进样阀。对于手动进样阀使用过程中需要注意每个样品进样完成后应对进样阀进行清洗,防止残留对下一个样品分析的影响。还需要注意进样方式,以20μL定量环为例,我们可以选择完全充满定量管或部分充满定量管。为了保证进样的重复性,选择完全充满定量管进样方式时,需要注入定量环体积3倍以上的样品;选择部分充满定量管进样方式时,进样体积应在定量管体积一半以下,即1-10μL。
 
  2、自动进样器。如果采用自动进样器进样,首先需要保证注射器里面没有气泡存在,否则影响进样量准确性;其次是样品瓶里面有足够的样品,保证进样针能够吸到样品。为了避免交叉污染需要定期对样品瓶、盖和垫进行清洗。若自动进样器长时间不使用,应该注意:腐蚀性的流动相或洗液(例如,碱性或酸性缓冲溶液)必须完全从系统中置换出来。同时,为了避免细菌的生长,应将一个样品瓶中充满甲醇,并重复几次进样操作。
 
  四、分离系统
 
  分离系统包括色谱柱、保护柱以及柱温箱。
 
  1、色谱柱。色谱柱是样品分离的核心。色谱柱在使用前必须仔细阅读说明书,了解色谱柱使用的pH值范围、溶剂耐受范围、压力范围和维护方法等事项。色谱柱使用完后,需及时对色谱柱进行冲洗。冲洗完成后,应该将色谱柱从仪器上拆下来,两端用厂家配的堵头密封后,保存在色谱柱盒里。
 
  2、保护柱。保护柱的作用主要是防止吸附性强的杂质对色谱柱污染,从而延长色谱柱的寿命。针对不同型号的色谱柱,应选择相对应填料的保护柱。应注意柱芯也是有寿命的,应该定期进行更换。
 
  3、柱温箱。色谱柱温度变化,可能会导致保留时间的变化。为了避免这个问题,建议使用柱温箱。
 
  五、检测系统
 
  HPLC常用的检测器是紫外检测器。在日常使用过程中紫外检测器主要需要注意检测池和氘灯的使用与维护。
 
  1、检测池。检测池长时间使用可能会造成污染,如果仪器的参比能量(REF ENERGY)正常,测量能量(SMP ENERGY)偏低,可能为检测池污染导致,可以对检测池进行清洗。对检测池零件的进行清洗,一般先采用约1:4的硝酸溶液超声清洗,分别用纯水和甲醇溶液清洗,然后重新组装并将检测池池体推进池腔内,拧紧池板螺丝。注意组装中,池玻璃及垫片一定要放正,以免压碎池玻璃,造成检测池泄漏。
 
  2、氘灯。氘灯正常使用寿命可在1500小时以上。灯的使用寿命与检测器的使用时间和开启频率有关,因此使用过程中应尽量节省不必要的开机时间,减少开关频率,以延长氘灯的使用寿命。如果准确地判断出氘灯已经不能点亮或能量太低,则需要更换新的氘灯。在购买氘灯时,应注意咨询和核对氘灯的型号与仪器型号是否匹配。更换到氘灯时,参照仪器说明书中的相关内容,特别要注意氘灯连接线的位置顺序。 昆明石杉HuperziakunmingensisChing.系石杉科石杉属植物,为我国特有种,主要分布于云南、贵州等地,生于灌木下、苔藓丛中。20世纪80年代,我国科学工作者从同属植物蛇足石杉中分离到石杉碱甲(Hup-A),并阐明它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂,对治疗重症肌无力、记忆力减退和早老年痴呆具有较好的效果,现已被广泛应用于临床。为了科学、合理地利用石杉属植物资源,本实验首次采用HPLC法对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定
 
1、仪器与试药
 
Aigent1100型HPLC色谱仪(带四元泵,自动进样器,紫外检测器等);电子分析天平(日本岛津);KQ50B超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(上海医疗器械厂);石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100243-200401);乙腈(色谱纯);二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。
 
实验药材采至贵州黔东南,由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉H.kunmingensisChing.,标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所,标本凭证(20056)。
 
2、方法与结果
 
2.1色谱条件ZORBAXSB-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8),检测波长为310nm,流速1ml·min-1,柱温25℃,进样量为5μl。在此色谱条件下,样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离,其理论塔板数为4656,对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15min,对照品与样品的色谱图见图1。
 
2.2样品的制备
 
精密称取实验药材细粉2g于500ml的圆底烧瓶中,每次加入200ml石油醚提取3次,弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次,合并滤液并回收溶剂,加入2%的酒石酸溶解,用氨水调节pH值至8.0,再用氯仿萃取至Dragendorffors反应呈阴性,挥干有机溶剂,用无水乙醇溶解并定容至25ml即得。
 
2.3线性关系的考察
 
精密称取石杉碱甲对照品2.40mg于25ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容,得浓度为0.096mg·ml-1对照品溶液,再分别稀释成0.096,0.048,0.024,0.012,0.006,0.003mg·ml-1的对照品供试液,在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回归,得方程:Y=6776.0151X1.0305,r=0.99995。可知石杉碱甲在0.015~0.48μg之间与峰面积呈良好线性关系。
 
2.4精密度实验取石杉碱甲对照溶液,在色谱条件下重复进样6次,结果石杉碱甲峰面积的RSD为0.36%(n=6)。
 
2.5稳定性实验取供试品溶液,每隔2h测定1次,考察石杉碱甲的含量变化,结果含量的RSD为0.85%(n=6),表明供试品在10h内稳定。
 
2.6重复性实验精密称样品6份,按“2.2”项的要求制备6份供试液,在色谱条件下分别进行测定,结果Hup-A含量的RSD为0.60%(n=6)。
 
2.7回收率实验精密称取昆明石杉药材细粉6份,每份1g,分别加入对照品供试液(0.003mg·ml-1)100ml,按样品制备方法和色谱条件,制备加样回收供试液进行测定,计算回收率(见表1)。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%,RSD=0.56%(n=6)。表1石杉碱甲加样回收率实验结果(略)
 
2.8样品的测定
 
按“2.2”项的要求精密称取样品3份,制备供试液,按色谱条件进行测定,重复3次,取平均值,石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。
 
3、讨论
 
首次采用HPLC法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。
 
测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定方法的基础上,改用ZORBAXSB-C18色谱柱及以0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)为流动相。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。
 


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