甘草为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎，始载于《本经》，药用历史悠久。其功能补脾益气、润肺止咳、缓急止痛、清热解毒、缓和药性。主要含有甘草酸及甘草苷类成分，其中甘草酸为现代药理应用研究证实具有抗纤维化、抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能等作用。目前针对甘草的内在质量控制，主要围绕甘草酸成分进行定性、定量一类的检查。2005版《中国药典》收载了RP-HPLC 三元等度洗脱法测定甘草酸的方法，规定甘草酸含量不得低于2%。本实验依托2005版《中国药典》一部甘草酸含量测定（附录VID）项下操作主线，采用RP-HPLC法测定甘草酸的含量，方法简便、快速，重现性好，结果稳定，用于甘草酸的检测专属性强，杭州赛析科技有限公司根据药典推出了501液相色谱仪用于甘草酸检测。效果理想，得到客户的认可，在中药饮片检测中起到重要作用。
仪器：
501液相色谱仪（配UV501检测器）、N2000色谱工作站、7725i手动进样阀
色谱条件
色谱柱：美国ZORBAX Exund C18分析柱（4.6mm×250mm,5μm）为固定相；
流动相：甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67∶33∶1）为流动相；
检测波长：250nm；
流速1ml·min-1；
柱温：室温。
柱效以甘草酸计，理论塔板数不应低于2000。
结果被测成分于7min 内即可出完，等度洗脱全程为0～20min。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取80℃干燥至恒重的甘草酸单铵盐0.1g对照品，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，使成每ml含有甘草酸单铵盐1 mg对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取甘草，研细（过3号筛），置烘箱内80℃干燥至恒重，精密称取0.3g，置100ml量瓶中，加流动相约45ml，超声处理（功率250W，频率20KH2）30min，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.4 测定方法
精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液色谱图中甘草酸的峰面积（3次平均）外标法计算甘草中甘草酸的含量（%，W/W）。
2.5 线性关系
精密吸取对照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、10.0ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，分别进样10μl，记录峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。甘草酸回归方程为Y=3.00029X+1.23099 r=0.99989，线性范围0.1033～1.0330μg。
2.6 精密度试验
精密吸取供试品溶液与上述色谱条件下进样10μl，重复5次，以被测成分峰面积分别计算，结果甘草酸 RSD=1.21%。
2.7 稳定性试验
精密吸取供试品溶液10μl，分别于0、2、4，6、8h进样，记录峰面积，结果甘草酸 RSD=1.45%。(n=5)。
2.8 重现性试验
取同一批次甘草药材按2.3项下提取制备5份供试溶液，分别精密吸取10μl进样，记录峰面积，结果甘草酸 RSD=1.32%。
2.9 回收率测定
取已知含量的甘草样品粉末约0.2g，精密称定9份，置10ml的量瓶中，样本中添加1mg/ml甘草酸对照品溶液1ml，按2.3项下操作，进样10μl，依2.4法测定, 记录峰面积并计算回收率，甘草酸平均回收率为99.04% RSD=0.79%，结果见表1。表1 甘草酸加样回收率实验结果（略）
2.10 样品测定
取6批样品，按2.3项下提取制备，依2.4项方法测定，重复测定3次，结果生药甘草的平均含量为7.85% RSD=0.85%。
3 讨论
3.1 洗脱溶剂系统的选择
本实验为RP-HPLC 三元等度洗脱法。选择甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67：33：1）作为洗脱溶剂，是基于甘草酸对三元等度洗脱系统的适应性的考量。胀果甘草中含有甘草酸、甘草苷等成分，因此只要选择适宜的洗脱溶剂系统，以促使各组分的分配系数较大，达到基线分离的效果。实验证明该方法简单、易行，设备要求相较梯度洗脱为低，早期一类设备都可用于检测，且抗干扰性强，具有专属性特点。
3.2 关于甘草酸
由生药甘草中提取的甘草酸，通常称之天然甘草酸，天然甘草酸存在顺反异构，且以顺式甘草酸含量为高，反式甘草酸含量极低。本实验未能揭示该异构体基线分离，可能与该异构体化学结构相似抑或是胀果甘草本身未含有反式甘草酸有关，尚待进一步研究。
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中低压液相色谱柱系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入中低压液相色谱柱内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来中低压液相色谱柱主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。
中低压液相色谱柱的保护：
1、流动相和样液都需用0.45um孔径的滤膜过滤。
2、加3～5cm保护柱。
3、进样阀进样。
4、用纯甲醇保存色谱柱，防止细菌生长。
5、防止过酸或过碱。
6、防止振动和逆向流动。
7、对硅胶基键合相，水溶液流动相的ph值不得超出2～8.5的范围，使用温度不宜过高。
8、中低压液相色谱柱在酸性或碱性条件下使用后，应依次用水和甲醇清洗。对暂时不用而需要较长时间保存的色谱柱，要用纯甲醇清洗。
9、中低压液相色谱柱两端用金属螺帽封闭，保存在干净的有机溶剂中。
中低压液相色谱柱的再生：
一般情况下，硅胶和ods等化学键合固定相再生是困难的。有时采用下述方法可能提高柱效。
1、由于杂质微粒等因素，使色谱柱上端固定相变色，柱效下降。这时，可仔细地将变色部分除去约3mm左右，再补充新的固定相。
2、当色谱柱吸附未被洗脱的成分时，柱效将明显下降，可选择合适的溶剂洗净。
3、当采用梯度洗脱时，色谱柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经色谱柱，以重新建立起始的平衡来得到再生。
①样品体积过大--用流动相配样,总的样品体积小于第—峰的15% ②样品溶剂过强--采用较弱的样品溶剂 ③柱塌陷或形成短路通道--更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 ④柱内烧结不锈钢失效--更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 ⑤进样器损坏--更换进样器转子 下一篇：冷热冲击试验箱技术参数
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